เนื่องจากเครื่อง HPLC เป็นเครื่องที่ต้องอาศัยความชำนาญและความละเอียดอ่อนในการใช้งาน
      ดังนั้นการใช้งานเพื่อให้มีประสิทธิภาพสูงสุดโดยไม่เกิดความเสียหายหรือขัดข้อง ประการแรกสุดที่ผู้ใช้
      เครื่องควรกระทำ คือ การศึกษาส่วนประกอบต่างๆ จากคู่มือ  ซึ่งนอกจากจะบอกวิธีใช้งานโดยละเอียด
      แล้ว ยังบอกข้อจำกัด ข้อพึงระวัง และการบำรุงรักษา เครื่อง HPLC แต่ละยี่ห้อจะมีรายละเอียดแตกต่างกัน
          ดังนั้นผู้ใช้จึงจำเป็นต้องทำความเข้าใจกับคู่มือประจำเครื่องโดยละเอียดก่อนลงมือใช้

          1. การเตรียมเครื่องก่อนใช้งาน
          ผู้ใช่ควรทราบก่อนว่า ในเครื่อง HPLC ขณะที่จะเริ่มทำการทดลองมี Solvent ชนิดใดอยู่ หากเป็นชนิดที่
       สามารถละลายได้ใน Solvent Mobile Phase  ที่กำลังจะใช้ก็ให้ปั้ม Solvent ใหม่ไล่ที่ของเดิมออกได้ทันที
        หากเป็น Solvent ที่ไม่ละลายกัน เช่น Hexane กับ Methanol ก็ให้ใช้  Solvent ตัวกลาง เช่น Chloroform
       ละลาย Solvent เดิมออกก่อนที่จะปั้ม Solvent ใหม่เข้าไป   หลังจากนั้นจึงติด Column เข้าไป และปั้ม
       Solvent Mobile Phase ผ่านเข้าไป จนสังเกตเห็นว่าค่า Absorpbance คงที่ จึงจะทำการ Injec สารเข้าไป

          2. การเตรียม Solvent Mobile Phase
               -  Solvent ที่ใช้ควรเป็น HPLC grade  ซึ่งผลิตมาให้ใช้กับเครื่อง HPLC โดยเฉพาะ
               -  Solvent ที่ใช้จำเป็นต้องกรองก่อน ด้วยกระดาษกรอง Membrane Filter ขนาด 0.45 – 0.5 ไมครอน
            โดยเฉพาะเมื่อมี Buffer ผสมอยู่ด้วย ทั้งนี้เพื่อกำจัดฝุ่นผงที่จะเข้าไปอุดตันใน Column ทำให้เกิดความเสียหายได้
               -  pH  ที่ใช้ต้องปรับให้อยู่ในระหว่าง pH 2-8 สำหรับใช้กับ Column ชนิด Silica Base ทั้งนี้เพื่อรักษาสภาพเดิม
           ของ Packing ของ Column
             -  การใช้ Degas เมื่อผสม Solvent  ตามสัดส่วนที่ต้องการแล้ว หากต้องการใช้ในทันทีจำเป็นต้อง Degas
            ก่อนเพื่อกำจัด Bubble ที่เกิดขึ้นขณะผสม ให้หมดไป

          3. การฉีดสารตัวอย่าง
          สารตัวอย่างที่จะฉีดเข้าเครื่อง HPLC จำเป็นต้องกรองด้วย Membrane Filter ขนาดเล็กว่า 0.5 ไมครอน
      ก่อนทุกครั้ง และ Solvent ที่ใช้ละลาย Sample หลังสุดควรเป็น Mobile Phase ทั้งนี้เพื่อป้องกันว่าจะไม่เกิด
      Precipitation หลังการฉีดเข้าไปในระบบแล้ว

          4.  การล้าง Column และเครื่อง HPLC เมื่อสิ้นสุดการใช้งาน
     การล้างจะทำทั้ง Column และเครื่อง HPLC ไปพร้อมๆ กันหลังการใช้งานแต่ละครั้ง โดยทั่วไปมีหลักการ ดังนี้
          -  กรณีเป็น Reverse Phase ไม่มี Buffer เช่น Methanol กับ น้ำ  ให้ใช้  Methanol 80 – 100%
         ล้างประมาณ 10 – 20 ml แล้วจึงถอด Column เก็บ
          -  กรณีเป็น Reverse Phase มี Buffer อยู่ด้วย เช่น Methanol , น้ำ , KH2PO4 ให้ใช้อัตราส่วนเดิมของ
       Methanol กับน้ำ ล้างประมาณ 20 – 30 ml แล้วปิดเครื่องถ้าต้องการใช้ต่อในวันรุ่งขึ้น แต่ถ้าต้องการเก็บ
        Column เลย ให้ล้างต่อด้วยน้ำ  100% 1ครั้ง และ Methanol 100% 1 ครั้ง ในปริมาณ 20 – 30 ml จึงเก็บ Column
          หากใช้ Guard Column  ร่วมด้วย การล้าง Guard Column  และ Column ควรล้างแยกกัน ทั้งนี้เพื่อไม่ให ้เกิด
      การปนเปื้อน จาก Guard Column  เข้าไปยัง Column

           5.  ข้อควรระวังอื่นๆ
              -  Buffer ที่ไม่ควรใช้ได้แก่ HX และเกลือของมัน
              -  การเก็บ Column และ HPLC System ไม่ควรเก็บไว้ในน้ำ หรือ Haloginated Hydrocaboon เช่น Chloroform
              -  เครื่อง  Detector ที่มีแหล่งกำเนิดแสง เช่น UV, RI ควรปิดเครื่องทันทีเมื่อใช้ เพื่อยืดอายุของหลอดกำเนิดแสง
              -  ควรใช้ Guard Column  และ Inline Pre Filter เพื่อยืดอายุการใช้งานของ Column ,Pump และ Injector

          ปัญหาที่เกิดกับ Column
               Column เป็นวัสดุสิ้นเปลืองใน HPLC อายุของ Column ขึ้นอยู่กับการใช้งานเป็นสำคัญ ปัญหาที่อาจเกิดกับ
          Column มีดังนี้
               1.High Pressure โดยทั่วๆ ไป ทุกๆ Column จะมี  Test Condition มาด้วย โดยระบุ Pressure ที่เกิดขึ้นเมื่อใช้
           Column นั้นที่ Flow Rate หนึ่ง  และใช้ Mobile Phase ชนิดหนึ่ง  เมื่อใช้งานไปนานๆ บางครั้งพบว่า Pressure
           จะสูงขึ้นกว่าเดิมมาก ปัญญานี้เกิดขึ้นจาก
               1.1  สิ่งเจือปนที่เป็นฝุ่นผง เศษโลหะ หรือเกลือที่ไม่ละลาย อื่นๆ ที่มีขนาดใหญ่กว่า 0.5 ไมครอน ซึ่งถ้าผ่าน
              เข้าไปใน Column จะทำให้เกิดการอุดตันที่ปลายด้าน Inlet ของ Column จะทำให้ Pressure สูงขึ้น
             การแก้ไข  :  ถอดหัว Column ออกแล้วนำ Filter ที่เป้ฯตัวกรองออกทำความสะอาดด้วยเครื่อง  Uitrasonic
               1.2  สิ่งเจือปนที่เป็นสารเคมี ได้แก่ Wax , Salt หรือสารที่ทำปฏิกิริยากับ Packing ภายใน ซึ่งหากผ่าน
              เข้าไปใน Column มักจะถูกจับไว้ที่ปลายด้าน Inlet และค่อยๆ สะสมไปเรื่อยๆ จนเกิดการอุดตัน จะพบว่า
              ขณะที่ใช้งาน Pressure จะสูงขึ้นเรื่อยๆ
             การแก้ไข : วิธีแรกที่ควรแก้ไขคือการพิจารณาลักษณะทางเคมีของสารปนเปื้อนตัวนั้น ว่ามีคุณสมบัติอย่างไร
              เช่นถ้าเป็น Wax มักจะละลายได้ดีใน Organic Solvent  ที่มี Polarity ต่ำ ซึ่งได้แก่  Hexane หรือ Chloroform
              ดังนั้นการกำจัด ทำได้โดยผ่าน Solvent เหล่านี้ไปบน Column ในปริมาณมากพอที่จะลายสารเจือปนออกได้หมด
              (Solvent ที่ใช้ประมาณ 10 – 20 ml) ในกรณีที่เป็น Salt ซึ่งละลายได้ดีในน้ำ ก็จะใช้น้ำเป็นตัวล้าง
          ข้อควรระวัง  : ในการล้าง Column คือ Solvent ใหม่ที่จะนำเข้าไปแทนที่ Solvent เดิมที่อยู่ในเครื่อง HPLC และ
           Column จะต้องสามารถละลายกันได้ดี
          2.  Peak Distortion
               เป็นลักษณะของ Peak ที่มีรูปร่างผิดไปจากเดิม ได้แก่ Broads peak หรือ Shadow peak
              Broads peak  เกิดจากสาเหตุ 2 ประการคือ
                    1.  Column เสื่อม เนื่องจากใช้งานภายใต้ Pressure สูงเป็นเวลานาน ลักษณะ Peak
             ที่ได้จะ Broad ทุก Peakเมื่อเทียบกับโครมาโทแกรมเดิม
               การแก้ไข : อาจใช้วิธี Regenerate แต่ส่วนใหญ่มักต้องเปลี่ยน Column ใหม่
                    2.  ปริมาณสารที่ฉีดเข้าไปมากเกินไป ทำให้เกิด Over  Loading
               การแก้ไข :  ให้ลดปริมาณการฉีดลง  

          Shadow peak เกิดจากปลายด้าน Inlet ของ Column ยุบลงเป็นแอ่ง ทำให้ Sample ตั้งต้นที่ Stationary Phase
        ในเวลาไม่เท่ากันหมดทุกโมเลกุล Peak ที่ได้จะมีลักษณะแตกเป็น 2 Peak  หรือเป็น  Shadow ซึ่งจะเกิดกับทุกๆ
        Peak ในโครมาโทแกรม
          การแก้ไข : หากเกิดกับ Column ที่มี Guard Column อยู่ด้วย ให้อุด Guard Column ออกแล้วตรวจสอบดูว่า
        ปลาย Inlet ของ Guard Column หรือตัว Column ที่เกิดปัญหา แล้วแก้ไขที่จุดนั้นโดยอาจจะเติม Packing
        ชนิดเดียวกับที่ใช้อยู่จนเต็ม

          การบำรุงรักษาเครื่อง HPLC ประจำวัน
               1. สังเกตและบันทึกรูปร่างของ baseline หรือการเปลี่ยนแปลงความดัน ถ้าได้รูปร่างหรือลักษณะของ
           baseline อันเนื่องมาจากผลความดันที่สม่ำเสมอ แสดงว่าระบบทำงานปกติ  แต่ถ้ามีรูปร่างหรือความดัน
           เปลี่ยนแปลงไป  แสดงว่า filter หรือในส่วนของเส้นทางการไหลภายใต้ความดันสูง hight pressure hydraulic
           path นั้นอุดตัน ซึ่งต้องทำการแก้ไข หรืออาจต้องเปลี่ยนใหม่
               2.  เมื่อสิ้นสุดการใช้งานแต่ละวัน ให้ตั้งโปรแกรมล้างระบบด้วยน้ำ แล้วตามด้วย ACN หรือ MeOH
            และปล่อยให้ตัวทำละลายอินทรีย์ดังกล่าวอยู่ในระบบและให้ใช้ขั้นตอนย้อนกลับ ในกรณีของการเริ่มใช้ครั้ง
           ใหม่การเก็บปั้มและคอลัมน์ในตัวทำละลายอินทรีย์ จะช่วยให้สามารถลดปริมาณการเจริญเติบโตของ
           แบคทีเรียได้อย่างมาก  buffer ที่นำมาใช้งานควรเตรียมมาใหม่ๆ หรือเปลี่ยนใหม่เป็นช่วง และถามี
           แบคทีเรียปรากฏให้เห็นก็ควรทิ้ง buffer   นั้นไป

          การบำรุงรักษาเครื่อง HPLC ประจำสัปดาห์
               1. ให้ล้าง proportioning ซึ่งเป็นวาล์วที่กำหนด สัดส่วนผสมของ mobile phase  อยู่ที่หัวปั้มที่ผ่านการ
           ใช้สารละลาย buffer มา โดยล้างด้วยน้ำก่อน แล้วตามด้วย ACN หรือ MeOH ปั้มในปัจจุบันส่วนใหญ่
           มักจะมีช่องหลังที่อยู่แถวๆบริเวณหลังหัวปั้ม ที่เรียกว่า ช่องล้าง (flushing port) ไว้สำหรับเป็นช่องที่ช่วย
           อำนวยความสะดวกในการล้างเกลือที่หัวปั้ม ซึ่งส่วนใหญ่มาจากการใช้สารละลาย buffer ของเหลวที่ใช้
           ล้างสาร จะไหลผ่านและออกมาบริเวณใต้หัวปั้ม
               2.  ตรวจสอบดูว่า inlet –filter หรือ reservoir filter ที่ขวด Mobile phase มีการอุดจันหรือไหลได้อย่าง
           อิสระหรือไม่ ทดสอบอย่างง่ายๆ  โดยถอดท่อที่ต่อกับหัวปั้มออกมา แล้วยกปลายท่อด้านที่ต่อกับหัวปั้มขึ้น
           ในระดับสูงกว่าทางด้าน reservoir filter แล้วดูว่าของเหลวที่ค้างอยู่ในท่อ สามารถไหลได้อย่างอิสระหรือไม่
           ถ้ามีการอุดตันให้นำไปล้างโดยใส่ในตัวทำละลาย แล้วนำไป Ultrasonic เพื่อไล่อนุภาคที่ติดอยู่ออก
               3.  ตรวจสอบดูว่า in-line filter (บางครั้งอาจเรียกว่า pre-column filter) ซึ่งเป็นชุดกรองอนุภาคที่อยู่
           ระหว่าง injector กับ guard column ว่าอุดตันหรือไม่ โดยตรวจจากค่าความดันของปั้ม ในขณะที่มีเพียง
           in-line filter  ในระบบ (โดนถอด guard column  และคอลัมน์วิเคราะห์) ในกรณีที่ความดันสูงมากกว่าปกติ
           ที่จะยอมรับได้ ควรเปลี่ยนแผ่นกรองหรือ frit ใหม่

          การบำรุงรักษาเครื่อง HPLC ประจำปี
                ปั้ม HPLC โดยทั่วไป ต้องมีการบำรุงรักษาประจำปี
          โดนต้องคอยเติมน้ำมันหล่อลื่นแก่ระบบทุกชิ้นตามคำแนะนำการบำรุงรักษาและใช้น้ำมันหล่อลื่นตามข้อ
           กำหนดของผู้ผลิต