การแยกและวิเคราะห์สารโดย HPLC จำเป็นต้องผ่านขั้นตอนการพิจารณาเลือกใช้ทั้งปริมาณ Sample ,
      Detector , Column และ Solvent Mobile Phase ให้เหมาะกับชนิดของสารนั้นๆ

          ขั้นที่ 1  การพิจารณาสารที่จะวิเคราะห์และ Matrix
       สารที่ต้องการวิเคราะห์ ผู้ใช้ HPLC  จำเป็นต้องทราบในเบื้องต้นว่าสารที่สนใจมีคุณสมบัติเช่นใด ดังนี้
          -  Stability
          - Solubility / Acidity
          - Molecular Structure / Weight
          - Ability of Absorp UV

           ชนิดและที่มาของ Sample (Matrix) ข้อมูลนี้จะช่วยให้ทราบว่าองค์ประกอบของ Sample มีอะไรบ้าง
      มีสารใดบ้างที่เราต้องการวิเคราะห์และน่าจะมีความเข้มข้นอยู่เท่าไร เป็นต้น
          การทราบข้อมูลในขั้นที่ 1 จะช่วยให้ตัดสินใจได้ว่าควรจะใช้ Detector ตัวใด และปริมาณ Sample
      ที่ใช้ควรเป็นเท่าไร การเตรียม Sample ควรทำด้วยวิธีใด

          ขั้นที่ 2 การเลือก Mode of Separation
            จากขั้นที่ 1 เมื่อทราบแน่นอนว่าสารนี้สามารถวิเคราะห์ด้วย HPLC ได้ และจากคุณสมบัติของสารเอง
      จะเป็นข้อกำหนดในการเลือก Mode ซึ่งได้แก่
       1. Adsorption (Normal Phase)
       2. Partition (Normal Phase)
       3. Ion Exchange
       4. Bonded Phase (Reverse Phase)

          ขั้นที่ 3   การเลือก Column
          เมื่อสามารถเลือก Mode of Separation ได้แล้วขั้นต่อไปคือ การเลือกใช้ Column ซึ่งจำกัดอยู่เฉพาะกลุ่ม
        ที่อยู่ใน Mode นั้นๆ  และโดยทั่วไปมักเลือกใช้ Column ดังนี้
          1. Adsorption                                   : Si / CN /NH2
          2. Partition                                       : Si
          3. Ion Exchange                               : Strong CX /AX
          4. Bonded  Phase                              : C18 / C8 / C6 / C2 / Phenyl 1 / CN / NH2

          ขั้นที่ 4 การเลือก Condition
          Condition ในที่ได้แก่
          -  ชนิดและสัดส่วนของ Solvent Mobile Phase
          -  Flow Rate ( 1 – 3 ml / min ขึ้นกับ Pressure)
          -  Detector / Sensitivity
          -  Injection Volume  (Concentration)
          หากเลือก Column และ Condition ที่เหมาะสมแล้ว ให้ทำตามขั้นตอนต่อไปนี้
          1. ใส่ Column และเตรียม Solvent จากนั้น Run ที่ Flow Rate 1 ml / min เพื่อไล่ฟองอากาศ ทำจนค่า
        Absorbance คงที่
          2. เตรียม Standard ที่ความเข้มข้นแต่ละตัวแตกต่างกัน ฉีดเข้าไปที่ละตัวและบันทึกค่า Retention time
        หาก Standard ไม่ออกจาก Column ให้เปลี่ยน Solvent ให้ Strong ขึ้น
          3. หาก Standard ยังไม่ออกหรือออกช้ามาก (นานกว่า 30 นาที) ให้เปลี่ยน Column ชนิดอื่น ที่มี Polarity ต่างกัน
          4. หาก Standard ออกตามข้อ 2 แต่ออกเร็วและไม่แยกจากกันให้เปลี่ยนเรียงลำดับดังนี้
               1.  Flow Rate
               2. Solvent Composition (%)
              3.  ชนิด Solvent
              4.  ชนิด Column