דביר נתנאלי

מבוא לביולוגיה מולקולרית

חלק ב' –  Genes 533-540

אימות תפקודי גנים במערכות תאיות ובמערכות לביטוי טרנסגנים

החומר להלן מקביל לתרגול מה-11/12/2001

 

הכנסת רצפי דנ"א חיצוניים לתאים ולבעלי חיים ע"י טרנספקציה

 

·       טרנספקציה (Transfection): הכנסת דנ"א זר מאורגניזם תורם לתוך תא מארח[1]

·        קו-טרנספקציה: טרנספקציה כפולה בה מוכנסים שני רצפי דנ"א לתוך תא מארח.

·        חיה טרנסגנית: חיה שקיבלה מידע גנטי חדש ע"י הוספת דנ"א זר לגנום שלה.

 

ניסויי הטרנספקציה הראשונים כללו הכנסת כרומוזומים בשלב המטאפאזה מאורגניזם תורם לתוך תרחיף תאים. תהליך זה אינו יעיל, ובמהלכו רק מספר קטן של תאים קולט חלקי דנ"א שמקורם בכרומוזומים ליצירת ואריינטים גנטיים (בהם נמצא שוני גנטי בעקבות הטרנספקציה). לרוב רק חלקי כרומוזומים נקלטים ע"י התאים ולא הכרומזומים בשלמותם (הכרומוזומים בשלב זה לא יציבים כי אין להם צנטרומר ולכן לא שורדים את התהליך). רק במקרים נדירים יווצרו ואריינטים גנטיים יציבים(stable lines), במקרה של השלבות הדנ"א מהתורם בכרומוזום התא המארח.

 

תוצאות דומות מתקבלות כאשר מוסיפים דנ"א מעובד (כשמבודדים את הרצף המעניין) לתאים מארחים, רק שבמקרה זה ניתן לשלוט ברצפי הדנ"א המדוייקים שיועברו ולא לסמוך על קליטת רצפי דנ"א אקראיים ע"י התאים המארחים.

 

טרנספקציה לא יציבה (Unstable transfection, Transient transfection) נוצרת כאשר מקטע הדנ"א שנקלט ע"י התא המארח אינו משתלב בכרומוזום התא. הדנ"א נשאר במצב חוץ-כרומוזומלי. מצב זה הינו זמני היות ותוך פרק זמן מסוים סביר שהמקטע יאבד, ולא יעבור לאורך הדורות של אותו line של תאים.

 

טרנספקציה יציבה (Stable Transfection) נוצרת כאשר ישנה השלבות של הדנ"א הזר בכרומוזום התא המארח. מצב זה הינו יציב כי במקרה זה יתוחזק הרצף המושתל ע"י מערכות התא בדומה לכרומוזום התאי.

 

בשני המקרים עשוי הדנ"א הזר לבוא לידי ביטוי, אבל בגלל התדירות הנמוכה שבה מתבצעת הטרנספקציה יש להתשמש בסמנים גנטיים שיאפשרו לקבוע האם מקטע הדנ"א שמעניין אותנו אכן נקלט בתא המארח. עושים זאת ע"י שתילת דנ"א המקודד לתוצר קל לניטור בתוך המקטע שאותו נחדיר לתא (למשל אנזים כלשהו).

 

 

 

 

דוגמא:

בניסויים רבים מסוג זה נעשה שימוש בגן tk המקודד את האנזים טימידין קינאז.

אנזים זה מזרז הוספת פוספטים לטימידין ליצירת טימידין טריפוספט המשמש כסמן בסינתיזת דנ"א.

כאשר מוסיפים לתאים מסוג tk^- (ללא הגן tk) תמיסה המכילה גן tk  טהור ואת הגנום של ΦX174, אז כל התאים מסוג tk⁺ שמתקבלים מכילים את שני הרצפים הזרים.

הסידור של רצף ה-tk  ורצף ה- ΦX174 שונה בכל line תאים שעבר טרנספקציה (כל התאים שמקורם באב קדמון), אך נשאר קבוע באותו ה-line  לאורך הדורות. ייתכן וימצאו מספר עותקים מכל אחד מהרצפים בתא המארח.

כמו כן, Revertants  (תאים בהם מתבטל השינוי הגנטי) מאבדים את שני הרצפים ביחד.

נראה שבמהלך הטרנספקציה נוצר קשר פיסי בין שני הרצפים ולפיכך גורלם יהיה משותף (הרצפים יהיו צמודים).

 

כדי לבצע טרנספקציה יש לעטוף את רצף הדנ"א שרוצים לשתול משני צדדיו בדנ"א נשא (Carrier DNA). היות ו-Revertants מאבדים את שני הרצפים ביחד, הסיקו שתא שעובר טרנספקציה מקבל חבילה גדולה אחת בלבד של דנ"א נשא המכיל בתוכו את הרצפים שברצוננו לשתול. גודל חבילה כזו הוא בד"כ כ-1000kb, ולרוב לאחר כניסתה לתא תבלה זמן מה כדנ"א חוץ כרומוזומלי, ואח"כ במקרים מסוימים תתבצע אינטגרציה עם הכרומוזום התאי.

ניתן להשתמש בהיברידיזציה על מנת לבדוק אם התבצעה אינטגרציה של הדנ"א הזר בכרומוזום התאי (אם נשרה מקטעי דנ"א שהינם הומולגיים לדנ"א הזר, יתבצע זיווג בסיסים בין המקטעים ההומולוגיים לבין המקטעים בכרומוזום התאי שמקורם בדנ"א הזר שהשתלב בטרנספקציה). כל line של תאים יכיל איזור יחיד שבו בוצעה איטגרציה, ומיקום איזור זה לאורך הכרומוזום התאי נקבע שרירותית.

 

אחד השימושים המרגשים של טכניקות הטרנספקציה הוא יצירת חיות טרנסגניות.

ניתן להשתמש בשיטה הישירה של הזרקת דנ"א זר לתא המארח ע"י הזרקת פלסמיד (המכיל את הגן שמעניין אותנו) לתוך גרעין ביצית של עכברה. לאחר מכן תוזרק הביצית לרחם של עכברה הרה.

אחוז סביר של כ-15% מהעכברים שיוולדו יכילו את הגן המוחדר, וכל אחד מהם עשוי להכיל 1-150 עותקים של הפלסמיד כאשר העותקים ממוקמים ברציפות זה לזה באתר אחד בכרומוזום.

 

 

 

השאלות העולות לגבי חיות טרנסגניות הן – כיצד משפיע אופן השתלבות הגן המוחדר  בכרומוזום על הביטוי שלו ?

ישנם כמה גורמים העשויים להשפיע על הביטוי של הגנים בצאצאים של חיה טרנסגנית:

1.      המיקום – השתלבות של הגן באיזור פעיל בכרומוזום תביא לביטוי גדול יותר של הגן מאשר השתלבות באיזור זבל.

2.      התרחשות שינויים אפיגניים – שינויים סביבתיים עשויים להשפיע על המבנה הגנטי של ההורים ולפיכך להשפיע על התבטאות הגן המוחדר בצאצאים.

3.      מספר העותקים מהגן – למרות שאין הקבלה בין מספר העותקים של הגן לבין רמת הביטוי שלו (פעמים גורמי השעתוק הם צוואר הבקבוק ולא מספר הפרומוטורים של הגן), יש להתחשב גם בגורם זה בחלק מהמקרים.

 

ניתן להשתמש בטכניקות אלו לתיקון מחלות גנטיות ע"י החלפת הגנים הפגומים בגנים מתפקדים.

 

דוגמא למקרה מוצלח כזה:

בעכבר ה-hpg (hypogonodal) חלה מוטצית מחיקה הגורמת לאי-פוריות.

כשמחדירים גן hpg תקין לעכבר כזה בטכניקות טרנסגניות, במידה והגן מבוטא (ב-2 מתוך 50) הגן מבוטא ברקמות המתאימות (לא תמיד קורה עם גנים אחרים...). לכל עכבר כזה יהיו למעלה מ-20 עותקים של הפלסמיד, ורק בחצי מהצאצאים שלו יבוא הגן לידי ביטוי והם יהיו פוריים.

 

           

הטכניקה של הזרקה ישירה של הדנ"א לגרעין תא אינה יעילה, היות ולא תמיד מתרחשת אינטגרציה של הגן המוחדר בכרומוזום (ואז הטרנספקציה אינה יציבה ונמוגה במהלך הדורות), וגם בגלל שאין לנו שליטה על מיקום ההשתלבות בכרומוזום (ואז אופן הביטוי אינו ניתן לשליטה במרבית המקרים). כמו כן תיתכן פגיעה בדנ"א של התא המארח (עשוי לדפוק לו את יכולת ההכפלה למשל). לפיכך רק באחוז קטן מאוד מהצאצאים של הורים טרנסגניים יתקבל האורגניזם הטרנסגני הרצוי.

 

טכניקה חילופית כוללת שימוש בווקטורים רטרו-ויראלים[2] הנושאים את גן התורם, ומסוגלים לשלב את הגן בכרומוזום התא המארח מבלי לפגוע במנגנוני ההכפלה שלו, והינם אף ספציפיים לרקמה.

 

שיטה יעילה נוספת ליצירת עכברים טרנסגניים מנצלת את תאי הגזע[3] העובריים הנוצרים מהבלסטוציסט (שלב התפתחות מוקדם המקדים את שקיעת הביצית ברחם).

הבלסטוציסט הוא כדור חלול, מלא נוזל, שנוצר מספר ימים לאחר ההפריה ומכיל מספר תאי גזע עובריים.

הרעיון בשיטה זו הוא לקחת את דנ"א התורם בתוספת גן מדווח כלשהו (המקודד לצבע שונה במקרה זה) ולהזריקו לתאי הגזע העובריים שנלקחו מבלסטוציסט.

נבודד בעזרת הגן המדווח את התאים שבהם הגן נקלט בהצלחה בכרומוזום. לאחר מכן ניקח את התאים הללו ונשתול אותם בבלסטוציסט של עכברה אחרת (בנוסף לתאי גזע אחרים שכבר קיימים שם).

הרקמות של צאצא אותה עכברה יתפתחו מ-2 סוגי תאים: אלו שהיו בבלסטוציסט ממנו נוצר, ואלו שהתווספו מלאכותית ומכילים את הדנ"א הזר. במידה ושני סוגי התאים הכילו גנים המקודדים לצבע פרווה שונה, הצאצא יהיה עכבר כימרי בעל 2 צבעים בפרוותו.

עתה נזווג את העכבר הכימרי עם עכבר בצבע של אימו, ואז נוכל לדעת שכל הצאצאים מהזיווג שהינם בעלי צבע הגן המדווח, מכילים גם את הדנ"א שאותו רצינו לשתול.

 

השיטה הנ"ל מתבססת על האפשרות לבצע מניפולציות כאלו על תאי הגזע, מבלי לפגוע בהתפתחותו הנורמלית.

 

שכלול של השיטות הטרנסגניות הנ"ל כולל knock-out של גן לא תקין ע"י רקומבינציה הומולוגית (שתחליף מקטע מסוים במדויק). במקרה זה נעשה שימוש ב-2 גנים מדווחים שונים שיאפשרו סלקציה כפולה. קודם נבדוק אם בכלל התרחשה טרנספקציה, ואח"כ נבדוק אם התרחשה רקומבינציה הומולוגית או הטרולוגית (ההטרולוגית יותר נפוצה).

הרעיון הוא להכניס רצף המכיל את גן תקין כשמשני צדדיו גנים מדווחים. באחוז מסוים מהמקרים תתבצע רקומבינציה הומולוגית בין הגן החיצוני התקין לבין הגן המקומי הדפוק, במהלכה יוחלפו שני הרצפים (התקין יכנס לכרומוזום התא במקום הדפוק). במקרה והתבצעה טרנספקציה מוצלחת, אבל רקומבינציה לא הומולוגית, יכנס לכרומוזום רק גן מדווח מאחד הצדדים. במקרה של רקומבינציה הומולוגית, יוחלף גם הרצף המכיל את הגן המדווח השני. ראה ציור.

 

סיכום:

 

ניתן להכניס רצפי דנ"א חדשים לתא ע"י טרנספקציה, או לתאי ביצית ע"י הזרקה (microinjection). הרצף הזר עשוי לעבור אינטגרציה אל הכרומוזום התאי, ובד"כ ישתלב כמערך של עותקים חוזרים. מערך זה נורש במהלך הדורות ביחידה אחת גדולה. אתר האיטגרציה נקבע שרירותית. חיה טרנסגנית נוצרת כאשר הדנ"א הזר משתלב בצורה קבועה בתא המארח וממשיך לעבור במהלך הדורות. הדנ"א הטרנסגני נורש בצורה מנדלית רגילה, אבל מספר העותקים שלו ואופן הביטוי של תוצר הרצף עשוי להשתנות בצאצאים. ע"י שימוש בחומרים מעודדים רקומבינציה ניתן להחליף גן פגום. ניתן לקבל עכברים טרנסגניים ע"י הזרקת תאי גזע עובריים ששונו גנטית לבלסטוציסט של עכברה הרה.