CONTAMINANTES QUE ACTUAN COMO HORMONAS.
Diversas técnicas permiten
hoy congelar embriones para posteriormente implantarlos con
propósitos experimentales o de producción animal. Se estima que
el tratamiento de la infertilidad humana podría beneficiarse con
tales implantes, campo en el cual deben observarse también
situaciones morales.
La preservación de
células animales a bajas temperaturas (criobiología) se remonta
al año 1866, fecha en la que Montegazza logró mantener vivos
espermatozoides después de haber congelado una muestra de semen
a –17°C; sin embargo, no es sino hasta el año 1949 que se
produce un avance sensacional en este campo. Efectivamente en ese
año los Drs. C. Polge, A.V. Smith y S.A. Parkes descubren que la
adición de glicerol (crioprotector) al medio de suspensión de
los espermatozoides, impide el daño celular provocado por la
congelación y descongelación del semen. Usando esta tecnología
se ha logrado mantener vivos espermatozoides de varias especies
en semen congelado a -79°C. Con posterioridad se ha establecido
técnicas que permiten congelarlos a la temperatura del
nitrógeno liquido (-196°C) por largos periodos.
La importancia del crioprotector se puede comprender mejor si se
considera lo siguiente:
Durante la congelación de las células se forma hielo
extracelular lo que lleva a un aumento en la concentración de
solutos. Esto provoca a su vez salida de agua desde las células,
fenómeno necesario para minimizar la formación de hielo
intracelular. La exposición de la célula a altas
concentraciones de solutos es tóxica, sin embargo, este daño
disminuye al bajar la temperatura. Aunque no está del todo claro
la acción del crioprotector, se acepta que ésta se encuentra
asociada a la reducción del sistema que se transforma en hielo.
Con posterioridad al descubrimiento del glicerol como
crioprotector de espermatozoides, se ha podido demostrar que
otras sustancias tales como el DMS0 (dimetil sulfóxido, CRECES 5
vol. 3); etilen-glicol, PVP (polivinilpirrolidona), y otros,
tienen propiedades crioprotectoras. En general, dos son las
propiedades que debe tener un crioprotector, la primera es que
sea muy soluble en agua y la segunda es que no sea tóxica para
la célula a congelar.
CONGELADOS
Y VIVOS
Los primeros experimentos asociados a la criopreservación de
embriones de mamíferos se realizaron en el año 1971 per los
doctores Whittingham, Leibo y Mazur, quienes demostraron que
embriones preimplantacionales de ratón se podían congelar a
temperaturas lo suficientemente bajas como para permitir
guardarlos por largos periodos. De esta manera se pudo recuperar
embriones vivos después de haber permanecido por un largo
periodo congelados a –196° C y a –269° C. Sin
embargo, desde un punto de vista practico, como veremos más
adelante, la temperatura del nitrógeno liquido (-196° C) es
suficientemente baja como para permitir su almacenamiento por
largo tiempo.
En la práctica de la criopreservación es conveniente recuperar
de cada hembra el mayor número de embriones. Esto se logra como
una técnica relativamente sencilla destinada a inducir a las
hembras a superovular, es decir que ellas ovulen un número de
oocitos varias veces mayor al número que ellas normalmente
producen, aumentando por lo tanto el rendimiento. La fecundación
in vivo o in vitro de estos oocitos llevará a la obtención de
embriones de desarrollo y edad conocidos.
MEDIO
DE CULTIVO ESPECIFICO
El estado del desarrollo en que los embriones se pueden congelar
varía con la especie, así por ejemplo, en algunas como el
ratón, la congelación se puede realizar con éxito en cualquier
estado del desarrollo, incluyendo oocitos recién ovulados. En
otras como la abeja, la congelación tiene éxito sólo a partir
de mórulas (32 células), y en la vaca sólo a partir del estado
de blastocisto (64 -128 células). En el cerdo, ningún embrión
sobrevive cuando la temperatura se baja de los 150 C.
Por lo anteriormente expuesto, los embriones pueden ser
congelados en un medio de cultivo específico. La elección de
este medio es muy importante, por cuanto la recuperación y
manejo previo a la congelación debe asegurar la sobrevida del
embrión.
En resumen, la técnica de la congelación consiste en suspender
en una ampolla los embriones en una pequeña cantidad (0,15 ml)
de medio de cultivo; a continuación la temperatura se baja hasta
0°C en donde se dejan por algunos minutos; luego se agrega el
crioprotector preenfriado a 0°C y se mantiene por breves minutos
para que esta mezcla se equilibre. En la criopreservación de
embriones de mamíferos se ha usado fundamentalmente glicerol,
etilen glicol y DMSO, siendo este último el más usado. El
segundo paso consiste en la inducción de formación de hielo, lo
que se logra a una temperatura de –5°C. A partir de este
momento la ampolla conteniendo los embriones se debe continuar
enfriando a una velocidad de más o menos 0.3°C/minutos, hasta
alcanzar –40° C. Una vez en esta temperatura la ampolla se
transfiere directamente a nitrógeno liquido. También se puede
hacer este traspaso cuando se alcanza –80°C. La temperatura
de transferencia a nitrógeno líquido debe ser considerada en
relación a la modalidad de descongelación, como se vera más
adelante.
ANIMACION
SUSPENDIDA
Los embriones que se han transferido al nitrógeno liquido pueden
teóricamente permanecer congelados por tiempo indefinido en un
estado de animación suspendida, debido a que a la temperatura
del nitrógeno liquido se suspende toda actividad biológica. A
dicha temperatura el único tipo de reacción que puede ocurrir
es la fotofísica, como por ejemplo, la radiación ionizante.
Este tipo de radiación puede provocar daño genético durante la
preservación a baja temperatura. Tal daño seria acumulativo,
debido a que los mecanismos enzimáticos necesarios para reparar
el daño están detenidos. Sin embargo es necesario destacar a
este respecto dos hechos importantes: el primero se refiere a que
el nivel basal de radiación natural es de 0.5 a 1.0 rad/año, y
el otro a que menos del 1%de las mutaciones espontáneas que
ocurren a temperaturas fisiológicas se pueden atribuir a la
radiación natural. Por estas razones se necesitaría entre 200 a
1000 años de almacenamiento para producir una reducción
significativa de sobrevida. Se han realizado experimentos en
embriones de ratón los cuales se han mantenido congelados por
dos años, lapso en el que recibieron un nivel de radiación
equivalente a 200 años; cuando estos embriones se descongelaron,
no se observó una pérdida adicional de embriones o un aumento
en las mutaciones con respecto a los embriones que no fueron
irradiados.
VENTAJAS
Entre las ventajas de la criopreservación se puede destacar que
los embriones congelados pueden ser transportados de un lugar a
otro en gran número y en forma relativamente simple la posterior
descongelación de ellos no requiere de equipos especiales;
simplemente basta un recipiente con agua caliente o bien dejar
las ampollas con los embriones a temperatura ambiente. La
modalidad de descongelamiento, por lo tanto, dependerá de la
temperatura a la cual son pasados al nitrógeno líquido. Si los
embriones a transferir estaban congelados a –40° C, la
descongelación se debe hacer en forma rápida
(350°-450°C/min); en tanto que si ellos estaban congelados a
–90°C la descongelación debe ser lenta (20° C/mm).
El método más directo para evaluar la viabilidad de los
embriones consiste en cultivarlos in vitro por 24 horas, si
éstos continúan dividiéndose ellos se pueden transferir a
hembras seudopreñadas, es decir a hembras que desde un punto de
vista funcional y endocrino se comportan como si estuvieran
preñadas, pero que no tienen embrión en su vía genital
(oviducto o útero). Si no es posible para el estudio de
vitalidad, cultivar los embriones, existen reacciones de
coloración vital que permiten una evaluación inmediata de la
sobrevida embrionaria y que no interfieren con el desarrollo
posterior.
En algunas especies de mamíferos, específicamente roedores, se
han podido también congelar oocitos recién ovulados, los que
después de ser descongelados han sido fecundados in vitro sin
observarse diferencias con respecto a oocitos no congelados.
GENOMA
¿Qué ventajas tiene la congelación de embriones con respecto a
la congelación de oocitos y/o espermatozoides? Parecería claro
que una ventaja importante de los embriones congelados es que
ellos pueden dar origen a un organismo cuando son transplantados
en una hembra seudopreñada. Este es un enorme beneficio desde el
punto de vista de la producción animal debido a que congelando
el embrión se está almacenando el genoma diploide, lo que tiene
obvias ventajas con respecto a la preservación de los gametos.
Las proyecciones de tipo práctico parecerían ser bastante
claras en el caso de la producción animal. Actualmente se está
explotando esta tecnología en el manejo genético en bovinos.
Las facilidades de transporte de grandes cantidades de embriones
de buena calidad genética permitirán reemplazar, en periodos
relativamente cortos, la población ganadera de una región o de
un país. Por otra parte esta técnica ofrece la posibilidad de
almacenar congelados cepas de animales de laboratorio,
evitándose así el enorme costo que implica su mantención en
viveros. En el momento requerido ellos pueden ser descongelados y
los embriones transplantados a hembras seudopreñadas y así
recuperar en cualquier momento la cepa deseada.
EN
EL SER HUMANO
Las posibles aplicaciones que esta técnica pueda tener en el
tratamiento de infertilidad humana pueden empezar a vislumbrarse
cuando ella se asocia a la técnica de fecundación in vitro de
oocitos humanos. En 1981 en Australia el Dr. A. Trounson congeló
embriones humanos preimplantacionales, producto de una
fecundación in vitro.
Sin embargo, hasta este momento no existen evidencias de que
ellos sean viables, ni tampoco se sabe que se hayan reimplantado
en el útero de alguna mujer receptora; de ser viables estos
embriones podría ser de considerable ayuda en el éxito de la
práctica de la fecundación in vitro, en parejas con problemas
de esterilidad por anomalías del oviducto de la mujer. Esto se
debe a que normalmente en la práctica de la fecundación in
vitro de oocitos humanos se trata de obtener y fecundar más de
uno a fin de asegurar el éxito de esta técnica. Ahora bien si
todos ellos se fecundan y todos ellos se desarrollan normalmente,
el médico se vera en la disyuntiva del destino de aquellos que
no serán reimplantados en la mujer en tratamiento. Una
alternativa seria reimplantar algunos (uno o dos) y el resto
guardarlos congelados para ser reimplantados con posterioridad
cuando la mujer desee comenzar otra gestación. Estas son
obviamente posibilidades que se presentan desde un punto de vista
biológico, sin embargo hay consideraciones de tipo ético y
moral, no examinadas aquí, que deberán considerarse en la
eventual aplicación de esta técnica en humanos.
Claudio Barros
Laboratorio de Embriología
Pontificia Universidad Católica de Chile
Biologia
Online 2000
Año 2000 - Colegio Almenar
del Maipo