APLICACIÓN DE LA TÉCNICA DE ELECTROFORESIS
(para diferenciar tipos de hemoglobina)
Objetivos
:1. Explicar el principio aplicado en la técnica de electroforesis.
2. Reconocer variantes de la hemoglobina a través de la técnica de electroforesis.
Materiales:
Centrifugadora
Cámara de electroforesis
Fuente de poder para la cámara de electroforesis
Imanes para sujetar las tiras de acetato de celulosa
Tiras de acetato de celulosa
Cubetas plásticas para las soluciones de ácido acético (3) y Ponceau's (1)
Capilares de vidrio
Muestras de sangre AA y AS (ó SS)
Solución amortiguadora (Buffer) de pH 8.6 - 9.16
Solución salina fisiológica
Cloroformo
Tinte Ponceau's
Ácido acético 5%
INFORMACIÓN PREVIA:
LA ELECTROFORESIS
La electroforesis es un método que permite el desplazamiento de una molécula (con carga eléctrica neta) dentro de un campo eléctrico. La molécula con carga se mueve en dirección al electrodo con signo opuesto.
En la electroforesis se aplica un campo eléctrico a lo largo de un soporte físico, generalmente geles (como por ejemplo, geles de agar, agarosa, almidón, acrilamida, etc.); también se pueden usar otros soportes como las tiras de acetato de celulosa. Las moléculas estudiadas que posean una carga neta (por ejemplo, macromoléculas tales como proteínas y ácidos nucleicos) se moverán dentro del campo eléctrico, separándose a medida que pasa el tiempo.
La velocidad (v) de migración de las moléculas dentro de un campo eléctrico depende de aspectos tales como:
a) la fuerza del campo eléctrico (E),
b) la carga eléctrica neta de la molécula (z),
c) el coeficiente de fricción de la molécula (éste depende de su tamaño y su forma).
La fuerza eléctrica Ez que conduce la molécula cargada hacia el electrodo con signo opuesto experimenta una resistencia fv; esta resistencia es causada por la fricción entre la molécula que se desplaza y el medio de desplazamiento (soporte físico). Esta fricción (f), por tanto, depende del tamaño y forma de la molécula que se mueve a través del campo eléctrico.
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LA ANEMIA FALCIFORME
La hemoglobina es una molécula transportadora de oxígeno; consta de cuatro cadenas polipeptídicas, cada una con un grupo hemo. La hemoglobina A, que es la predominante en los adultos, tiene la estructura subunitaria a 2 b 2. La hemoglobina fetal (a 2g 2) tiene mayor afinidad por el oxígeno que la hemoglobina del adulto.
El cambio de un solo aminoácido en una sola proteína, causado por una mutación génica, puede producir una enfermedad. La enfermedad molecular mejor comprendida es la anemia falciforme. La hemoglobina S, la hemoglobina anormal en los pacientes con esta enfermedad, consta de dos cadenas a normales y dos cadenas b mutantes. El cambio de un aminoácido en la cadena b de la hemoglobina S es la sustitución de del glutamato en la posición 6 por valina. Esta sustitución de una cadena lateral polar por una apolar, reduce drásticamente la solubilidad de la desoxihemoglobina S. La hemoglobina desoxigenda forma precipitados fibrosos que deforman al eritrocito y le dan forma de hoz. La anemia falciforme se produce cuando un individuo es homocigoto para el gen mutante falciforme en la cadena b . La condición heterocigota denominada rasgo o carácter falciforme, es relativamente asintomática.
La identificación del tipo de hemoglobina de una muestra sanguínea se efectúa por comparación de las velocidades de migración de los desconocidos en relación a controles de hemoglobina conocidos. El orden de velocidad de migración es: HbA (más veloz), HbF (hemoglobina fetal , menos veloz), HbS (más lenta).
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PROCEDIMIENTO:
PREPARACIÓN DE LA SANGRE:
- Centrifugar 5 mL de sangre por 5 minutos a 3000 r.p.m. (para remover el plasma).
- Lavar los eritrocitos con solución salina fisiológica, tres veces. Para esto se centrifuga cada vez por tres minutos a 3000 r.p.m. (remover el sobrenadante después de cada centrifugación.
- Agregar 0.4 mL de cloroformo y agitar vigorosamente por 5 minutos.
- Centrifugar por 15 minutos a 3000 r.p.m.
- Separar el hemolizado del sobrenadante.
PREPARACIÓN DE LA ELECTROFORESIS:
- Colocar una tira de acetato de celulosa dentro de una cubeta conteniendo solución buffer (pH 8.6 - 9.2); dejar allí por 5 minutos.
- Sacar la tira de la solución y eliminar el exceso de buffer.
- Colocar la tira en la cámara de electroforesis (tal como le indicará el profesor); arreglar de forma que quede bien extendida.
- Use un capilar para aplicar las muestras en la tira de acetato de celulosa.
- Añada suficiente buffer dentro de la cámara hasta que haga contacto con los extremos de la tira.
- Corra la muestras por unos 30 minutos a 250 - 300 V.
- Saque la tira, una vez que se cumpla el tiempo de corrida.
- Tiña la tira con el Ponceau's durante 10 minutos (no agite).
- Decolore la tira agitándola suavemente en un baño de ácido acético al 5% hasta que el fondo rojizo sea removido (se realizan tres baños sucesivos).
- Secar la tira en un incubador por 10 minutos a una temperatura entre 60 - 100º C.
- Observe la tira y aprecie las diferencias de movilizaciones de las hemoglobinas empleadas.