50 Porotos germinados. METABOLISMO: LA RESPIRACIÓN
Materiales que debe conseguir el estudiante
: 50 Porotos germinados.
Algodón (motas).
Levadura seca (no "baking powder").
1 ratón blanco.
1 lagartija.
1 rana pequeña (p.e. "túngara").
1 insecto (grillo, cucaracha u otro).
Gotero.
Materiales que deben estar presentes en el laboratorio
: Solución saturada de Ba(OH)2, filtrada (transparente). MANTENERLA TAPADA SIEMPRE.
Solución de glucosa.
Suspensión de levadura.
Soluciones de NaF (0.01M, 0.05M y 0.10M). TENGA CUIDADO, ES TÓXICO.
Azul de metileno diluido (una gota en 100 ml de agua).
Perlas de NaOH.
Matraces de 200-500 ml para armar el sistema de captura de CO2 producido en la respiración (haga "clic" aquí para ver la figura correspondiente).
Embudo.
Tapones de caucho con dos perforaciones.
Tubos de caucho para conectar con tubos de vidrio.
Soporte metálico.
Vasos químicos de 200 ml.
5 parejas de tubos de ensayo con las misma características físicas (cinco tubos de capacidad para 9-15 ml, todos iguales en diámetro y longitud; y 5 tubos de un diámetro ligeramente mayor que los 5 primeros, que permita introducir a los de menor diámetro en ellos). Haga "clic" aquí para ver la figura correspondiente.
Botella de vidrio de capacidad aproximada de 300 ml (como los de jugo de uva "Welch", tamaño mediano). Se usará para construir un respirómetro sencillo (haga "clic" aquí para ver figura correspondiente).
Tapón de caucho conectado con una pipeta delgada (graduada en décimas de ml).
Botella pequeña (capacidad de 4-5 ml), para colocar perlas de NaOH. Haga "clic" aquí para ver figura correspondiente.
Procedimiento:
I. COMPROBACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE CO2 DURANTE LA RESPIRACIÓN.
A. Producción de CO2 en la Respiración Anaerobia.
1. Arme el sistema tal como aparece en la figura.
2. Prepare una suspensión de levadura: caliente 60ml de agua hasta que alcance una temperatura de 40º C. Añada 5 gramos de glucosa y 5 gramos de levadura y revuelva bien.
3. Vierta la suspensión de levadura dentro del matraz Nº1 (observe el de la
izquierda de la figura superior). Coloque inmediatamente el tapón correspondiente. Coloque una pinza en el tubo de caucho que está unido al tapón de este matraz, y presiónelo. Agregue agua en el embudo (esta no debe caer).4. Coloque otra pinza para que presione el caucho que conecta a ambos matraces.
5. Agregue la solución de Ba(OH)2 en el matraz Nº2 (tenga el cuidado de no dejar destapado el recipiente que lo contiene y tape inmediatamente este matraz, para que la solución no entre en contacto con el CO2 del aire).
6. Coloque una tercera pinza presionando el caucho del tubo libre del tapón del matraz Nº2.
7. Espere 25 minutos. Luego, suelte las 3 pinzas (comenzando desde la que está en el matraz Nº2 hasta llegar a la del matraz Nº1). Una vez que suelte la pinza del matraz Nº1, empezará a caer el agua contenida en el embudo dentro del matraz. Esto impulsará los gases contenidos en él hacia el matraz Nº2. Debe tener el cuidado de no permitir que el embudo se quede sin agua (tenga a mano un vaso químico con agua para ir reponiendo el agua del embudo).
8. Observe cualquier cambio en el color del Ba(OH)2 del matraz Nº2 y la formación de un precipitado insoluble. ¿Qué significan estos cambios?
B. Producción de CO2 en la Respiración Aerobia.
1. Arme el sistema igual como en el caso anterior (ver la figura anterior).
2. Ahora, en vez de suspensión de levadura, introduzca las 50 semillas germinadas en el matraz Nº1 y coloque el tapón.
3. Espere 1 hora.
4. Suelte las pinzas, tal como se describió en la parte A7.
5. Observe cualquier cambio en el color del Ba(OH)2 del matraz Nº2 y la formación de un precipitado insoluble. ¿Qué significan estos cambios?
II. EFECTO DE UN ANTI-METABOLITO EN LA RESPIRACIÓN.
La secuencia de reacciones involucradas en la degradación de la glucosa hasta la producción de piruvato es muy similar en todos los organismos. Sin embargo, la diferencia entre éstos es el destino del piruvato en la generación de energía metabólica. La degradación anaeróbica de la glucosa se llama fermentación y tiene un bajo rendimiento de ATP, si la comparamos con la degradación bajo condiciones aeróbicas (glucólisis). En condiciones anaeróbicas, ciertos organismos microscópicos (como la levadura) tienen la capacidad de transformar el piruvato en etanol y CO2. La conversión de la glucosa en etanol se llama fermentación alcohólica. La reacción neta de este proceso anaeróbico es:
Glucosa + 2 Pi + 2 ADP +2 H+
-----> 2 etanol + 2 CO2 + 2 ATP + 2 H2O**
(Stryer, Lubert. 1993. Bioquímica)La levadura es un organismo anaeróbico facultativo, esto significa que en condiciones en donde escasea el oxígeno, tiene la capacidad de utilizar una vía anaeróbica de degradación de la glucosa. Como consecuencia de esto se forma etanol a partir del piruvato. Una enzima que participa en este proceso degradativo de la glucosa se llama
enolasa. La enolasa cataliza la reacción que convierte el 2-fosfoglicerato (2PG) en fosfoenolpiruvato (PEP). La reacción resumida es la siguiente:3PG
--(1) --> 2PG --(2) --> PEP --(3) --> Piruvato --(4) --> Acetaldehído + CO2 --(5) --> Etanol(1) fosfogliceromutasa; (2) enolasa; (3) piruvato cinasa; (4) piruvato descarboxilsa; (5) alcohol deshidrogenasa.
Esta enzima requiere la presencia de iones Mg2+ para poder reaccionar; el flúor provoca la precipitación de los iones magnesio, por tanto inhibe la reacción de la enolasa. Si añadimos NaF diluido a una suspensión de levadura, el efecto inhibidor será notado por la disminución en la producción de CO2 (en forma creciente de acuerdo a la concentración de NaF). Como NaF inhibe la formación del metabolito llamado PEP, NaF es un antimetabolito (si no se produce PEP entonces no se producen los siguientes metabolitos, y en consecuencia no ocurre la descarboxilación del piruvato ni se produce CO2).
A. Efecto del NaF en la Producción del CO2 durante la respiración de la Levadura:
1. Seleccione 5 parejas de tubos de ensayo (tal como fue descrito en la sección de materiales).
2. Prepare una suspensión de levadura: caliente 60ml de agua hasta que alcance una temperatura de 40º C. Añada 5 gramos de levadura y revuelva bien.
3. Tome cada pareja de tubos y enumérelos (de 1 a 5), colocando la numeración en el tubo de mayor diámetro. Agregue las sustancias que corresponden, de acuerdo a la siguiente tabla, en el tubo más pequeño de cada pareja (vea el
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Nº Tubo * |
Suspensión de levadura |
Agua destilada |
Solución de glucosa 10 % |
NaF |
|
1 |
5 ml |
10 ml |
--- |
--- |
|
2 |
5 ml |
5 ml |
5 ml |
--- |
|
3 |
5 ml |
--- |
5 ml |
5 ml ( 0.01 M) |
|
4 |
5 ml |
--- |
5 ml |
5 ml ( 0.05 M) |
|
5 |
5 ml |
--- |
5 ml |
5 ml ( 0.10 M) |
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* Note que en todos los casos, el volumen total de contenido en cada tubo son 15 ml; además, cada sustancia que se añade a cada tubo representa un tercio del volumen total (excepto en el tubo Nº1, en donde el volumen de agua corresponde a 2/3 del total). Sin embargo, esta medida puede ser variada de acuerdo al volumen que quepa en los tubos pequeños de cada pareja. Por ejemplo, si el volumen que puede contener un tubo son 9ml, un tercio de esta cantidad son 3ml; esto significa que en vez de 5ml de cada sustancia debo colocar 3ml para que quepan dentro del tubo.
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4. Ahora, introduzca el tubo pequeño dentro del grande tal como se aprecia en la figura (secuencia de dibujos desde "b" hasta el "d").
5. Invierta la pareja de tubos tal como se aprecia en la
figura, de tal forma que el tubo de mayor diámetro (externo) está en posición normal y el tubo interno se encuentra invertido. Vea la figura correspondiente.
6. Coloque las cinco parejas de tubos en un vaso químico con agua tibia (aproximadamente a 40º C). Deje en incubación por 45-60 minutos (vea la figura).
Nota
: Es importante que anote la hora en que preparó cada tubo para que sepa con exactitud cuando se cumple el tiempo de incubación. Debe tomarse el mismo tiempo para cada tubo. Además, es importante medir el espacio de aire que queda atrapado dentro del tubo pequeño de cada pareja; se mide con una regla._____________________________________________________________
7. Anote sus resultados en la tabla que aparece abajo:
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Nº Tubo |
Medida inicial* |
Medida final* |
Diferencia de medidas |
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1 |
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. |
. |
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2 |
. |
. |
. |
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3 |
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. |
. |
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4 |
. |
. |
. |
|
5 |
. |
. |
. |
*
la medida corresponde a la altura del espacio de aire en cada tubo (medida desde el nivel de suspensión de levadura hasta la parte superior del tubo pequeño).8. Extraiga conclusiones de sus observaciones.
III. METABOLISMO ANIMAL.
A. Medida del Consumo de O2:
1. Arme un respirómetro tal como se observa en la figura.
2. Debe pesar cada animal (expresar la medida en gramos). Los animales que se usarán son: insecto, lagartija, rana y un ratón (uno por vez).
3. Una vez que pese al animal, introdúzcalo dentro de la botella (respirómetro). Dentro de la botella debe colocar una botella pequeña con dos perlas de NaOH (colocar una mota de algodón no compactada en la boca de la botella, para impedir que el animal introduzca la boca en ella).
4. Coloque el tapón de caucho que tiene conectada la pipeta; el tapón debe quedar firmemente adherido a la boca de la botella.
5. Espere dos minutos. Luego, coloque dos gotas de azul de metileno diluido (como fue indicado en la sección de materiales) en la punta de la pipeta, mediante un gotero.
6. Seleccione dos marcas de la pipeta, una será el punto de inicio de la medición y la otra, el punto de término. Cuando comience a moverse el tinte en la pipeta, espere que llegue al punto de inicio; una vez llegue allí comience a medir el tiempo que tarda en llegar al punto de término. Si es posible repita el experimento otra vez con el mismo animal.
7. Calcule el consumo de oxígeno. Este se expresa en ml de O2 consumido por hora.
B. Cálculo de la tasa metabólica:
1. Calcule la tasa metabólica de cada animal y compare sus resultados en una tabla.
