Extracción de ADN en Eucariotas
Materiales:
· 1 cebolla grande
· Solución de detergente Vel: agregar 50 ml de
detergente Vel en un vaso químico de 500 ml. Preparar una solución de NaCl en
otro vaso químico (7.5 gramos de NaCl y 100 ml de agua destilada). Agregar la solución de NaCl al detergente y
mezclar suavemente procurando no formar espuma; completar con agua destilada
hasta alcanzar un volumen de 500ml.
· Etanol frío
· Bolsa de hielo.
· Cuchillo (para cortar la cebolla).
· Baño de agua a 60º C.
· Licuadora.
· Sal
· Vaso químico de 500ml.
· Jugo de piña natural (aprox. 20ml).
Procedimiento:
1.
Corte la cebolla en tiras. Coloque las tiras en un vaso químico de
500ml.
2.
cubra la cebolla con 100ml de solución
de detergente (tal como se indica en la sección de materiales).
3.
Coloque el vaso químico, que contiene la
cebolla y la solución de detergente, dentro de un baño de agua a 60º C por 15
minutos (revolviendo constantemente, mediante una varilla de vidrio).
4.
Inmediatamente transcurren los 15
minutos en el baño de agua caliente, transfiera el vaso químico a un baño de
hielo por 5 minutos (manteniendo agitación constante).
5.
licuar la mezcla (cebolla / sol. de
detergente) 1 minuto a baja velocidad.
6.
filtrar el licuado de cebolla mediante
papel filtro de café (teniendo el cuidado de mantener el recipiente, que
recibirá el filtrado, en un recipiente con agua helada).
7.
Tomar un tubo de ensayo de capacidad de
20 ml y añadir en él 6 ml del filtrado y 3.5 ml de jugo de piña (éste contiene
la enzima bromelina). Tapar el tubo con el pulgar y voltear el tubo una sola
vez para que se mezclen.
8.
Añadir 9 ml de etanol frío lentamente
(inclinando ligeramente el tubo y permitiendo que el alcohol se deslice por las
paredes del tubo).
9.
Dejar reposar el tubo en un vaso químico
con agua helada por 15 minutos (el ADN no es soluble en Etanol frío).
10. observe una capa intermedia con apariencia de
sustancia como mucosidad densa (ese es el ADN).
11. Enrolle el ADN mediante una pipeta Pasteur y guárdelo en una solución de
NaCl 4% y manténgalo en refrigeración hasta la próxima clase.
Función de cada una de las sustancias o condiciones participantes en el proceso de extracción de ADN, realizado en el
laboratorio
· Cebolla: la usamos porque ella tiene bajo contenido de almidón, así permite que
el ADN sea visto con claridad.
· Detergente (detergente líquido Vel): provoca la rotura de la membrana celular y emulsifica
los lípidos y proteínas de la célula impidiendo las interacciones polares que
mantienen la integridad de la membrana. El detergente forma complejos con estos
lípidos y proteínas causándoles precipitación.
· NaCl: prepara a la molécula de ADN
para que se precipite en la solución de alcohol porque forma un escudo
alrededor de los extremos fosfato, los cuales presentan carga negativa. Los iones de sodio de la sal
son atraídos por las cargas negativas del ADN, neutralizándolas.
· Tratamiento con calor por 15 minutos (a
60º C):
· Suaviza los fosfolípidos de la membrana celular.
· Desnaturaliza la enzima (proteína) DNAsa (desoxirribonucleasa). Al inactivar esta enzima se impide que ella
corte (degrade) el ADN en fragmentos pequeños (recuerde que queremos rebobinar
el ADN en la pipeta Pasteur).
· No puede realizarse por más de 15 minutos porque provoca que la molécula
de ADN se corte en fragmentos pequeños.
· Hielo: disminuye la tasa de degradación del ADN.
· Mezcla en la licuadora por un minuto a
baja velocidad: rompe las paredes
celulares, membranas celulares y cubiertas nucleares, permitiendo la separación
del ADN. Rompe las células y expone las
paredes celulares y membranas a la acción del detergente.
· Papel Filtro de café: permite separar la mayor parte de los fragmentos
vegetales que quedan después del "licuado".
· Etanol (70-99%) bien frío: permite separar y reconocer el ADN ya que éste no es
soluble en etanol frío. Todos los
componentes de la mezcla quedan en solución, excepto el ADN que al no ser
soluble en etanol frío se separa (el ADN se verá como una "baba" o
masa viscosa (como un moco blancuzco).
· Solución de ablandador de carne o jugo
natural de piña: Ella contiene una
enzima proteolítica (llamada papaína u otra enzima parecida, en el caso del
ablandador de carne y bromelina, en el caso de la piña) que ayudará a separar el
ADN de las proteínas.
· Reactivo de Disché (contiene Difenilamina ): Es un indicador de la presencia de ADN. Se debe calentar 1ml de muestra con 3ml de
Reactivo de Disché por 40 min., en un tubo de ensayo tapado con algodón; inmediatamente se transfiere el tubo a un
baño de agua fría. La presencia de ADN se comprueba por la formación de un
complejo coloreado azul.