Biochemischer Grundkurs WS 1998/1999

 


Praktikanten:

Thomas Sandmann

Dirk Hockemeyer
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Protokoll zu Versuchstag 7:
 


Fragmentierung von Immunoglobulin G

Und Immunoblotting

Prinzipien und Methoden


 


Der Versuch gliedert sich in drei Teile:

  1. Spaltung von Kaninchen-Immunglobin (IgG) zu F(abė)2-Fragmenten durch Pepsin
  2. Trennung der Fragmente sowie der Polypeptidketten des IgG im Vergleich zu Markerproteinen durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) mit zwei unterschiedlich konzentrierten Gelen (8%, 12%)
  3. Nachweis der H-Kette des IgG unter den Polypeptiden in einem Immunoblot
Pepsin spaltet IgG an eine charakteristischen Stelle auf jeder der beiden schweren Ketten. Dabei bleibt die Verbindung der leichten Ketten über eine Disulfidbrücke erhalten und es entstehen die 2 Fragmente Fc , die Reste der schweren Kette enthalten und ein Fragment F(abė)2, das die leichten Ketten sowie den verbindenden Gelenkabschnitt beinhaltet. Dieser Versuchsteil wird mit den Proben B1-B3, sowie D und F durchgeführt.

Die Disulfidbrücken, die im intakten IgG leichte und schwere Ketten sowie die schweren Ketten untereinander verbinden, können durch Mercaptoethanol gespalten werden. Die in Kombination mit dem Pepsin-Verdau entstehenden Spaltprodukte werden in den Ansätzen A1-A3 untersucht, in Ansatz C wird IgG ohne vorherigen Verdau mit Mercaptoethanol versetzt.

Reaktionsgleichungen (Molekulargwichte siehe Diskussion der Ergebnisse):

  1. Spaltung von IgG mit Pepsin:


    2. IgG 2 Fc + F(abė)2
  2. Reduktive Spaltung von IgG durch Mercaptoethanol


    3. IgG 2 leichte Ketten (L) + 2 schwere Ketten (H)
  3. Reduktive Spaltung von F(abė)2
F(abė)2 2 leichte Ketten + 2 (Hv + Gelenkregion)

Hv = variabler Teil der schweren Kette (carboxyterminales Ende)
 
 



Auswertung

  1. Bestimmung des Molekulargewichts der Protein-Fragmentbanden.


    2. Die mit Coomassie-Blue angefärbten SDS-Polyacrylamid-Gele enthalten folgende Banden des Markerproteins (für die Eichgeradenerstellung wird, da der Marker nur wenige verwertbare Banden enthält, die Pepsin-Bande aus Ansatz F mit verwendet):

    8%-Gel

    Markerprotein Molekulargewicht [d] Laufstrecke l [cm] Rf
    Pepsin
    35000
    3,55
    0,79
    Glutamat-DH
    53000
    2,8
    0,62
    Transferrin
    76000
    2,2
    0,49
    b -Galaktosidase
    116000
    1,9
    0,42

    12%-Gel

    Markerprotein Molekulargewicht [d] Laufstrecke l [cm] Rf
    Lactalbumin 14000 4,5 1,00
    Trypsininhibitor 20000 3,5 0,78
    Carboanhydrase 30000 2,4 0,53
    Ovalbumin 43000 1,6 0,36
    Albumin 67000 0,85 0,19
    Phosphorylase b 94000 0,5 0,11

    Laufstrecke des Bromphenolblaus im Trenngel (=l0) : 4,5 cm

    Der Rf-Wert errechnet sich nach folgender Gleichung:
     



     


    Es besteht ein linearer Zusammenhang zwischen dem Rf-Wert und dem Logarithmus des Molekulargewichtes. Daher kann mit Hilfe einer Eichgeraden das unbekannte Molekulargewicht der Fragmente bestimmt werden.

    Diagramm 1: Eichgerade für die 8%-ige SDS-PAGE

    Diagramm 2: Eichgerade für die 12%-ige SDS-PAGE

    Die Geradengleichungen, die eine lineare Regression liefert, lauten:

    8%-iges Gel: log(Molekulargewicht) = -1,3 . Rf + 5,6

    12%-iges Gel: log (Molekulargewicht) = -0,9 .Rf + 5,0

    Jetzt können aus den abgelesenen Laufstrecken der zu bestimmenden Fragmentbanden die Rf-Werte berechnet und über die Geradengleichungen auf das Molekulargewicht geschlossen werden.

    Ansatz A1:
     
    Laufstrecke von Einzelbanden [cm] Laufstrecke von verschmierten Banden [cm], jeweils Anfangs- und Endwert Rf-Wert Errechnetes Molekulargewicht [d]
    2,7
    0,60
    28840
    3,5
    0,78
    19953
    1,5
    0,33
    50119

    Ansatz A2:
     
    Laufstrecke von Einzelbanden [cm] Laufstrecke von verschmierten Banden [cm], jeweils Anfangs- und Endwert Rf-Wert errechnetes Molekulargewicht [d]
    2,7
    0,60
    28840
    3,5
    0,78
    19953
    1,5
    0,33
    50119

    Ansatz A3:
     
    Laufstrecke von verschmierten Banden [cm], jeweils Anfangs- und Endwert Rf-Wert errechnetes Molekulargewicht [d]
    2,7
    0,60
    28840
    3,5
    0,78
    19953

    Ansatz C (IgG):
     
    Laufstrecke von Einzelbanden [cm] Laufstrecke von verschmierten Banden [cm], jeweils Anfangs- und Endwert Rf-Wert errechnetes Molekulargewicht [d]
    2,7
    0,60
    28840
    3,5
    0,78
    19953
    1,5
    0,33
    50119

     

    Ansatz E (Pepsin):
     
    Laufstrecke von Einzelbanden [cm] Rf-Wert errechnetes Molekulargewicht [d]
    1,9
    0,42
    41687

     

    Ansatz B1:
     
    Laufstrecke von Einzelbanden [cm] Laufstrecke von verschmierten Banden [cm], jeweils Anfangs- und Endwert Rf-Wert errechnetes Molekulargewicht [d]
    1,2
    0,27
    179198

    Ansatz B2:
     
    Laufstrecke von Einzelbanden [cm] Laufstrecke von verschmierten Banden [cm], jeweils Anfangs- und Endwert Rf-Wert errechnetes Molekulargewicht [d]
    1,9
    0,42
    112489
    2,3
    0,51
    86210
    1,2
    0,27
    179198

    Ansatz B3:
     
    Laufstrecke von verschmierten Banden [cm], jeweils Anfangs- und Endwert Rf-Wert errechnetes Molekulargewicht [d]
    1,9
    0,42
    112489
    2,3
    0,51
    86210

    Ansatz D (IgG):
     
    Laufstrecke von Einzelbanden [cm] Laufstrecke von verschmierten Banden [cm], jeweils Anfangs- und Endwert Rf-Wert errechnetes Molekulargewicht [d]
    1,2
    0,27
    179198

    Ansatz F (Pepsin):
     
    Laufstrecke von Einzelbanden [cm] Rf-Wert errechnetes Molekulargewicht [d]
    3,55
    0,79
    37536

    Die unterstrichenen Werte sind im Immunoblot zu erkennen und enthalten demnach lange Ketten des IgG (H-Ketten).

  2. Diskussion der Produkte der Pepsin-Spaltung des IgG wie sie die Coomassie-Färbung sichtbar macht unter Einbeziehung des Immuno-Blots.
Pepsin-Spaltung ohne Zerstörung der Disulfidbrücken:

Ansatz B1:

Es entstehen die Fragmente Fc und F(abė)2. Der Verdau wird allerdings schon nach 30 Sekunden abgebrochen, so daß hauptsächlich unverdautes IgG in der Probe enthalten ist. Auf der Coomassie-Färbung ist es als eine diskrete Bande bei einem Molekulargewicht von ca. 180000 d zu erkennen, die auch in der Antikörper-Färbung des Blots auftritt.

Ansatz B2:

Hier wird der Verdau 5 Minuten lang fortgesetzt, dabei wird ein Teil des IgG in die Fragmente (siehe B1) gespalten. Neben der IgG-Bande ist nun auch die verschmierte Bande von F(abė)2 im Bereich von 86000 - 112000 d zu erkennen, die keine Antikörperreaktion im Blot auslöst, da die schwere Kette gespalten worden ist. Die Fc-Fragmente, die dabei ebenfalls entstehen, sind auf unserem Gel nicht zu erkennen.

Ansatz B3:

Nach zwei Stunden Verdau ist kein ungespaltenes IgG mehr vorhanden, die diskrete Bande bei ca. 180000 d ist verschwunden. Die verschmierte F(abė)2-Bande ist dagegen intensiver geworden.

Ansatz D (IgG):

Das unverdaute IgG ruft eine Bande bei ca. 180000 d hervor und bestätigt deshalb die Interpretation der Ansätze B1bis B3. Da die schweren Ketten unversehrt sind, ist diese Bande im Immunoblot deutlich zu erkennen.

Ansatz F (Pepsin):

Das monomere Enzym Pepsin zeigt erwartungsgemäß eine Bande bei ca. 38000 d und ruft keine Antikörperreaktion im Blot hervor.

Pepsin-Spaltung und anschließende Spaltung der Disulfidbrücken mit Mercaptoethanol:

Ansatz A1:

Wie unter Ansatz B1 beschrieben bilden sich bei der Spaltung von IgG mit Pepsin die Fragmente F(abė)2 und Fc. Wie in B1 ist nach 30 Sekunden hauptsächlich unverdautes IgG vorhanden, das durch Mercaptoethanol in leichte Ketten (L) und schwere Ketten (H) zerfällt. Die schwere Kette bei ca. 50000 d sind sowohl auf dem Gel als auch im Immunoblot deutlich zu erkennen. Die breite Bande auf dem Gel von 20000 d bis 28000 d die leichten Ketten (L).

Ansatz A2:

Der Verdau ist nach 5 Minuten bereits weiter fortgeschritten. Die Banden, die in Ansatz A1 charakterisiert worden sind, sind auch hier noch vorhanden, allerdings repräsentiert die breite Bande auf dem Gel von 20000 d bis 28000 d nun auch die Fragmente Hv+Scharnierregion (>22000) und die Fc-Fragmente (< 22000).

Ansatz A3:

Nach 2 Stunden ist alles IgG von Pepsin gespalten worden. Deshalb sind keine unversehrten H-Ketten mehr zufinden, die Bande bei ca. 50000 d ist verschwunden. Die breite Bande von 20000 bis 28000 d enthält nun nur noch die Fragmente Hv+Scharnierregion und die Fc-Fragmente. Im Immunoblot ist keine Bande mehr zu erkennen, da die Antikörper nur auf vollständige H-Ketten anspechen.

Ansatz C:

Das reine IgG wird in leichte und schwere Ketten gespalten, die dasselbe Bandenmuster ergeben wie in Ansatz A1.

Ansatz E:

Das monomere Enzym Pepsin zeigt eine Bande bei ca. 42000 d und ruft keine Antikörperreaktion im Blot hervor.
 






Fehlerbetrachtung


 


Die Ergebnisse entsprechen im Großen und Ganzen den theoretischen Erwartungen. Die ungenauen Eichgeraden, die teilweise starke Abweichungen von den theoretischen Molekulargewichten hervorbringen, sind zumindest zum Teil auf die schlecht auswertbaren Markerbanden in der SDS-PAGE zurückzuführen. Dadurch ergeben sich zu hohe Molekulargewichte. Das wird daran deutlich, daß bei Proteinen mit bekanntem Molekulargewicht wie IgG und Pepsin starke Abweichungen sichtbar werden. Außerdem scheint zumindest eine Teil der Proben nicht im 8%-Gel sondern im Puffer daran vorbei gelaufen zu sein (z.B. Ansatz B1).

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