Praktikanten:
Thomas Sandmann
Dirk Hockemeyer
Protokoll zu Versuchstag 5:
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Auswertung
Zu 1)
Das Gesamtplasmid wird aus dem Vektor pGEM-He-Juel und dem EcoRI Fragment der rMCTI DNA gebildet.
Ausgangsgrößen:
Zu 2)
Die optimale Temperatur für die Anlagerung der Primer in der PCR ist abhängig vom Verhältnis der enthaltenen Basen:
Ta = [(GC-Gehalt) . 4 + (AT-Gehalt) . 2]
Für Primer rMCT5s: Ta= 64 °C
Für Primer rMCT75: Ta= 62 °C
Um eine maximale Anlagerung zu erreichen, ist deshalb eine Temperatur von ca. 62 °C vonnöten, da bei einer höheren Temperatur der zweite Primer schon zu mehr als 50% vom Matrizenstrang abdissoziiert. Es wird bei 55°C gearbeitet, um das Verhältnis von Anlagerung zu Dissoziation noch weiter zur Anlagerung zu verschieben.
Bei der PCR wird mit den verwendeten Primern ein Fragment von 414 Basen amplifiziert. (Höchste bps-Zahl der Primer ó niedrigste bps-Zahl der Primer +1)
Tabelle siehe Datenblatt 1
Zu 3)
Es ergeben sich für den Ort der Bam HI-Schnittstelle zwei Positionen im Plasmid. Mit Bam HI wird entweder hinter Position 691 (bps) im Gesamtplasmid geschnitten oder hinter Position 1379 (bps) im Gesamtplasmid. Es gibt zwei mögliche Schnittstellen, da nicht festgelegt ist, in welcher Orientierung das Insert eingefügt wird. Bei einem Restriktionsverdau mit Bam H1 sind deshalb Fragmente mit der Basenlänge 598 und 4321 (richtige Orientierung) bzw. 1286 und 3633 (falsche Orientierung) sichtbar. In der Analyse der Agarosegele findet sich allerdings nur an zwei Stellen eine fluoreszierende Bande, was einem Schnitt mit Bam HI im Plasmidring entspricht (bei zwei möglichen Entfernungen zur zweiten Bam HI-Schnittstelle wären vier Banden zu erwarten gewesen.) Wahrscheinlich handelt es sich bei den verwendeten Bakterien um einen Stamm, der auf die Bildung des richtigen Transkripts hin selektiert wurde.
Eichgerade für den DNA-Standard
Die Proportionalität zum Logarithmus der Strecke gilt offensichtlich nur für die kleineren Fragmente, nicht für die drei längsten. Die ersten drei Punkte werden deshalb bei der linearen Regression vernachlässigt.
Geradengleichung: ln(Basenzahl) = 9,3 ó 0,66 * Laufstrecke
| Abgelesene Strecke in cm vom Ende der Tasche ab (Restriktionsverdau) | Zahl der Basen | Erwartete Basenzahl
(bei richtiger Orientierung des Gen-Fragmentes) |
| 1,6 | 3805 | 4321 |
| 4,45 | 580 | 598 |
Der zweite Wert stammt aus dem Gel der Gruppe, die
die RNase hinzugefügt hat, da bei unserem eigenen Gel diese Bande
in der verschmierten RNA-Bande verschwunden ist.
| Abgelesene Strecke in cm vom Ende der Tasche ab (PCR) | Zahl der Basen | Erwartete Basenzahl |
| 5,0 | 403 | 414 |
Zu 4)
Sehr nah an den Taschen des Gels findet sich eine kurzer Bereich verschmierter, nicht sehr intensiver Banden. Dabei handelt es sich um genomische DNA des Bakteriums, die nicht abgetrennt worden ist. Bei 0,9 cm Laufstrecke und ca. 1,8 cm Laufstrecke sind eine intensive, realtiv scharf abgegrenzte Banden zu sehen. Dabei handelt es sich um den Plasmid-Ring. Weil er im Gel keine gestreckte Form annehmen kann, läßt seine Basenzahl sich nicht mit unserer Eichgeraden bestimmen; die Voraussetzungen sind nicht identisch. Er verursacht zwei Banden, da der "Ring" zwei Konformationen annehmen kann: "relaxed" und "supercoiled". Die superspiralisierte "supercoiled" Form durchläuft das Gel schneller (1,8 cm), während der "Ring" zurückbleibt (0,9 cm). Außerdem findet sich im Bereich ab 2,7 cm Laufstrecke eine lange, verschmierte Bande hoher Intensität, die bei der Gruppe, die Substanz x hinzugefügt hat, fehlt. Es handelte sich bei Substanz x offensichtlich um eine RNase, die die RNA, die bei der DNA-Präparation nicht abgetrennt wurde, abgebaut hat. Da in unserem Fall keine RNase zugesetzt worden ist, ist die RNA ins Gel gelangt und für die unspezifische Bande jenseits 2,7 cm verantwortlich.
Nach der Zugabe des Restriktionsenzyms "verschiebt" sich die RNA-Bande nach unten. Das bedeutet, daß die langen RNA-"Polynukleotide" (wahrscheinlich mRNA) "verschwunden" sind. Die Erklärung dafür könnte sein, daß RNase-Verunreinigungen in die Probe gelangt sind, die bei der Reinigung nicht abgetrennt werden konnten. Diese haben Teile der RNA abgebaut, so daß nur noch kürzere Stücke im Gel sichtbar werden.
Der Vergleich mit der Seminargruppe 4 ist uns leider nicht möglich, da kein Verteter von Seminargruppe 4 auf unserem Gel zu finden ist. Zu erwarten wäre allerdings auch kein Unterschied bezüglich der Intenstität des PCR-Produkts, da bei einer Amplifikation von 230 (für jedes Template) die 1:100 Verdünnung und die 1:1000 Verdünnung schließlich zu einer ähnlichen Zahl von Kopien führen.