Praktikanten:

Thomas Sandmann

Dirk Hockemeyer
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Protokoll zu Versuchstag 4:
 

Anhand eines vorbereiteten Enzymextraktes aus Leber sollen die für die einzelnen Teilschritte des Harnstoffcyclusë erforderlichen Komponenten ermittelt werden.

• Der Proteingehalt des Enzymextraktes wird mit der Biuretmethode bestimmt und die Menge des gebildeten Harnstoffs auf die Menge des eingesetzten Proteins bezogen.

• Die Menge des synthetisierten Harnstoffs wird in einem gekoppelten enzymatischen Test bestimmt. Die Glutamat-DH bildet unter NADH-Verbrauch aus NH4+ und a -Ketoglutarat die Aminosäure Glutamat. Die Urease zersetzt den während der Inkubation gebildeten Harnstoff in CO₂ und NH₄⁺, letzteres wird dann über die Dehydrogenase über NADH-Verbrauch in Glutamat eingebaut. Bei der von Urease katalysierten Reaktion von Harnstoff zu CO₂ und NH₄⁺ werden zwei Teile NADH zu NAD⁺ umgewandelt. Über die bekannte Soffmenge an Harnstoff in den Lösungen kann man auf die umgesetzte NADH-Stoffmenge schließen. Der gesamte Harnstoff wird abgebaut, damit entspricht die umgesetzte Harnstoffmenge dem doppelten NADH-Umsatz (Stoffmenge).

Proteinbestimmung:

Um eine Eichgerade zu erstellen, werden 6 Ansätze mit unterschiedlicher Harnstoffkonzenration hergestellt, sukzessive mit Glutamat-Dehydrogenase und anschließend mit Urease versetzt und die jeweiligen Extinktionsänderungen bei 340 nm verfolgt. Bei dieser Wellenlänge hat NADH ein Absorptionsmaximum, NAD⁺ dagegen nicht.

Harnstoffbestimmung:

Zu verschiedenen Ansätzen von Substraten des Harnstoffcyclusë und den Proteinen des Leberextraktes wird nach einer Inkubationszeit von 1 Stunde bei 37°C und 10 minütigem Hitzedenaturieren zuerst 5 m l Gutamat-Dehydrogenase-Lösung und nach erfolgter Gleichgewichtseinstellung weitere 5 m l Urease-Lösung zugegeben.

Das Ammonium stammt in Ansatz 7 aus Ammoniumhydrogencarbonat. Die Extinktion wird nur in den Ansätzen 7 bzw. 9 verfolgt, in allen anderen Ansätzen werden nur die Endwerte bestimmt.
 

1. Proteinbestimmung:


Es wird ein Rinderserumalbumin-Standard zur Eichung der Proteinbestimmung verwendet. Mit Hilfe der Biuretmethode wird die Extinktion der BSA-Standardlösung und von Verdünnungen des Leberextraktes bei 560 nm gemessen.

Ansatz	Proteinkonzentration in mg/ml	Extinktion
1 (Standard)	0	0,256
2 (Standard)	0,91	0,415
3 (Standard)	1,82	0,61
4 (Standard)	2,73	0,808
5 (Standard)	3,64	0,982
6 (Standard)	4,55	1,18

Die Extinktionen der Standardwerte werden in Form einer Eichgeraden gegen ihre Konzentration aufgetragen. Über die ermittelte Geradengleichung berechnet man die Proteinkonzentration des Leberextraktes.
 




Geradengleichung: y = 0,24 + 0,20 ^. x


 




Stellt man diese Gleichung nach x um, erhält man aus den Extinktionen die Konzentration der zugesetzten Proteine in der Küvette.
 

Ansatz	Extinktion	zugesetzte Proteinkonzentration in mg/ml	Eingesetztes Volumen Protein-extrakt in ml	Konzentration der Enzymextraktes in mg/ml
7	0,397	0,753	0,040	18,8
8	0,453	1,027	0,060	17,1
9	0,524	1,374	0,080	17,2
10	0,593	1,711	0,100	17,1

Mittelwert der Konzentration der Proteinstammlösung: 17,553 mg / ml

2. Verlauf der enzymatischen Reaktionen

Punkt B entspricht der Zugabe von Urease
 
 

3. Harnstoffbestimmung:

gegen die Stoffmenge aufgetragen.

(Diese Umrechnung ist prinzipiell richtig, verbessert aber die Genauigkeit des Ergebnisses nicht, da der Fehler durch Pipettieren, etc. größer ist.)

Anfangsvolumen : 1,0 ml

Volumen nach Glutamat-DH-Zugabe: 1,005 ml

Volumen nach Urease-Zugabe: 1,01 ml

Die in den Ansätzen enthaltene NADH-Menge (NADH₀) läßt sich aus der Konzentration des Reagenzienmixes und den eingesetzten Volumina bestimmen.
 

Ansatz	11	12	13	14	15	16
Stoffmenge NADH0 in m mol	0,199	0,199	0,199	0,199	0,199	0,199
Stoffmenge Harnstoff in m mol	0,01	0,02	0,04	0,06	0,08	0,1
Nach der Reaktion übriges NADH in m mol	0,179	0,159	0,119	0,079	0,039	-0,01

In Ansatz 16 ergibt sich rechnerisch eine negative Konzentration an NADH nach der Reaktion. Das ist unmöglich, also wird NADH zum begrenzenden Faktor dieser Reaktion werden. Das wird auch in der Eichkurve bestätigt, die Kurve knickt bei hoher Harnstoffkonzentration ab. Dieser Wert wird deshalb bei der linearen Regression nicht beachtet.
 

Harnstoff-menge in den Standards in m mol	Verbrauchte NADH-Menge in m mol	Extinktion.Vo-lumen vor der Urease-Zugabe in ml	Extinktion.Vo-lumen nach der Urease-Zugabe in ml	D (Volumen.Ex-tinktion) in ml
0,01	0,02	1,34167	1,14635	0,19532
0,02	0,04	1,38087	1,05141	0,32946
0,04	0,08	1,38288	0,77669	0,60619
0,06	0,12	1,37584	0,49692	0,87892
0,08	0,16	1,37283	0,30098	1,07185
0,1	0,2	1,37785	0,27977	1,09808

Die Steigung dieser Eichgeraden entspricht dem Extinktionskoeffizienten:

e = 6,38 mM^{-1 .} cm^-1

Der Literaturwert beträgt 6,22 mM^{-1 .} cm ^{ó1. Das ergibt eine prozentuale Abweichung von 2,6%.}

4. Harnstoffausbeute

Über die in Aufgabe 2 erstellte Eichgerade läßt sich nun auf den Harnstoffumsatz zurückschließen. Wie schon bei der Betrachtung der Standards muß die Verdünnung berücksichtigt werden (Produkt aus Extinktion und Volumen). Außerdem werden pro umgesetzem Molekül Harnstoff 2 Moleküle NADH verbraucht (Faktor 0,5). Die Stoffmenge wird bei bekannter Ÿnderung des Produktes Extinktion^.Volumen mit dem oben bestimmten Extinktionskoeffizienten 6,38 mM^-1. cm^-1 berechnet.
 

Ansatz	Extinktion vor Urease-zugabe	Extinktion * Volumen vor Urease-zugabe in ml	Extinktion nach Ureasezugabe	Extinktion . Volumen nach Urease-zugabe in ml	D (Volumen.Extinktion) in ml	Stoffmenge NADH in m mol	Harnstoff-umsatz pro Stunde in m mol
1	0,887	0,891	0,736	0,743	0,148	0,023	0,012
2	1,298	1,304	0,864	0,873	0,432	0,068	0,034
3	0,821	0,825	0,649	0,655	0,170	0,027	0,013
4	0,854	0,858	0,650	0,657	0,202	0,032	0,016
5	1,253	1,259	1,036	1,046	0,213	0,033	0,017
6	1,308	1,315	0,996	1,006	0,309	0,048	0,024
7	1,107	1,113	0,992	1,002	0,111	0,017	0,009
8	1,131	1,137	1,046	1,056	0,080	0,013	0,006
9	1,335	1,342	0,981	0,991	0,351	0,055	0,028
10	1,128	1,134	1,045	1,055	0,078	0,012	0,006

Um den Harnstoffumsatz auf den Leberextrakt zu beziehen, wird der Umsatz pro Stunde durch die enthaltene Menge Protein dividiert. Allerdings liegen im Leberextrakt nicht nur die nötigen Enzyme vor, sondern noch viele weitere Proteine.
 

Ansatz	Enthaltenes Enzym in mg	Harnstoffausbeute/Enzymmasse.Zeit(h) in m mol.mg-1.h-1
1	0,790	0,015
2	0,079	0,429
3	0,790	0,017
4	0,790	0,020
5	0,079	0,211
6	0,079	0,306
7	0,158	0,055
8	0,158	0,040
9	0,039	0,705
10	0,158	0,039

 
 
 

5. Ergebnisse der einzelnen Reaktionsansätze


In den verschiedenen Ansätzen 1-10 wurden unterschiedliche Substrate / Stoffe zum Leberextrakt gegeben, der alle Enzyme des Harnstoffcyclus enthält.
 

Ansatz	Harnstoff-ausbeute/Enzym-masse.Zeit(h) in m mol.mg-1.h-1
1	0,015
2	0,429
3	0,017
4	0,020
5	0,211
6	0,306
7	0,055
8	0,040
9	0,705
10	0,039

Je nachdem, welche Stoffe in der Reaktionslösung enthalten sind, kann Harnstoff produziert werden, oder nicht. Im folgenden Abschnitt werden die fehlenden Elemente des Cyclus genannt, bzw. das Ergebnis der Messung diskutiert.

Ansatz 1:

Für die Umsetzung von ATP werden Mg²⁺-Ionen benötigt. Diese werden nicht zugegeben. Stattdessen wird mit EDTA ein Komplexbildner zugefügt, den größten Teil der zweiwertigen Kation aus dem Leberextrakt bindet. Es wird so gut wie kein Harnstoff gebildet.

Ansatz 2:

In diesem Ansatz sind Mg²⁺-Ionen vorhanden, EDTA wurde nicht zugesetzt. Außerdem steht Citrullin zur Verfügung, das mit dem im Energiemix enthaltenen Aspartat und ATP im Harnstoffcyclus zu Arginino-Succinat umgesetzt wird. Der Harnstoffcyclus läuft.

Ansatz 3:

Hier finden wir dieselben Komponenten wie in Ansatz 2, allerdings fehlt der Energiemix. Der Cyclus darf deshalb eigentlich nicht ablaufen. Der Harnstoffumsatz ist fast null.

Ansatz 4:

Für die Bildung von Harnstoff aus Ornithin ist Carbamoylphosphat nötig. Dieses ist weder vorhanden, noch wurden die nötigen Ausgangsstoffe NH₄⁺ und HCO₃^- zugesetzt. Deshalb kann so gut wie kein Harnstoffumsatz gemessen werden.

Ansatz 5:

Da kein Ornithin vorhanden ist, fehlt der Akzeptor für Carbamoylphosphat. Der Harnstoffcyclus kann nicht starten. Der gemessene Harnstoffumsatz könnte auf noch im Leberextract vorhandenes Ornithin zurückzuführen sein.

Ansatz 6:

Carbamoylphosphat und (im Gegensatz zu Ansatz 5) Ornithin sind vorhanden. Damit kann Citrat und schließlich Harnstoff gebildet werden.

Ansatz 7/8:

Eigentlich sind alle Ausgangsstoffe vorhanden, allerdings fehlt ein wichtiger Aktivator der Carbamoyl-Synthetase I, das N-Acetyl-Glutamat, so daß die Reaktion nur langsam abläuft óes kann nur die Basalaktivität gemessen werden. In Ansatz 8 wird N-Acetyl-Glutamat zugesetzt, der niedrige gemessene Harnstoffumsatz muß hier andere Gründe haben: Pipettierfehler (z.B. N-Acetyl-Glutamat vergessen,...), etc.

Ansatz 9:

Zur Harnstoffbildung muß nur das vorhandene Arginin gespalten werden. Die Reaktion läuft, bis diese Aminosäure verbraucht ist, da kein Carbamoylphosphat nachgeliefert werden kann.

Ansatz 10:

Ohne Enzyme kann der Harnstoff-Cyclus nicht ablaufen. Der gemessene Harnstoffumsatz von 0,039 m mol^.mol^-1.h^-1 ist demnach auf noch vorhandenen Harnstoff zurückzuführen sein, auf Verschleppen von Lösungen (ist in jedem Fall möglich) oder auf ungenaue Messungen.

Gesamtbetrachtung:

Die Meßwerte entsprechen in den Fällen, in denen der Harnstoffcyclus ablaufen kann, den Erwartungen. In den Fällen, in denen keine Harnstoffproduktion zu erwarten war, lassen unsere Meßwerte keine klare Aussage zu. Es ist davon abzuraten, aus diesen Ergebnissen den Harnstoff-Cyclus ableiten zu wollen. Mit bekanntem Cyclus ist er allerdings zu bestätigen.
 
 

6. Harnstoff- und Ammoniakgehalt des Harns

Die Berechnung erfolgte analog zu den bereits beschríebenen Bestimmungen.

Die Harnstoffmenge in der Küvette entspricht einer 1:20000-Verdünnung. Die molare Masse von Harnstoff ging mit 60 g/mol in die Rechnung ein. Außerdem mußte Verhältnis Harnstoff:NADH = 1:2 wie oben beachtet werden.

Die Berechnung des Ammoniakgehaltes ist analog zur Harnstoffbestimmung. Hier gilt allerdings das Verhältnis Ammoniak:NADH = 1:1. Die molare Masse wurde mit 17 g/mol eingrechnet. Außerdem wurde hier die Differenz zwischen der Extinktion vor der ersten Enzymzugabe (Glutamat-DH) und vor der Urease-Zugabe gebildet. Um die Verdünnung zu berücksichtigen wurde wieder das bekannte Produkt

Extinktion^. Volumen benutzt.
 

Ansatz	Extinktion vor Glutamat-DH- zugabe	Extinktion * Volumen vor Glutamat-DH- zugabe in ml	Extinktion nach Glutamat-DH- zugabe	Extinktion . Volumen nach Glutamat-DH- zugabe in ml	D (Volumen.Extinktion) in ml	Stoffmenge NADH in m mol
17	1,415	1,415	1,271	1,277	0,138	0,022
18	1,416	1,416	1,372	1,379	0,037	0,006

 
 

Ammoniakstoffmenge in 1:20000-Verdünnung in m mol	Ammoniakgehalt in m mol/ml	Ammoniakgehalt in 1,5 l Harn (=24h) in mmol	Ammoniakgehalt von  1,5 l Harn in g
0,022	43,162	64,743	1,101
0,006	116,462	174,693	2,970

Mittelwert: 2,0355 g/1,5 l
 
 
 
 
 
 

Bewertung der Ergebnisse:

Sowohl der Harnstoffgehalt als auch der Ammoniakgehalt sind viel zu hoch. Das könnte sich einerseits durch Meß- und Pipettierfehler erklären lassen, z.a. ist zu berücksichtigen, daß die Stichprobe ca. 30 Minuten nach dem Mittagessen erfolgte. Die Normalmenge von 27g Harnstoff und 0,85 g NH₃ ist dagegen ein auf 24 h bezogener Durchschnitt. Der untersuchten Person geht es bis heute gut.