Die Kenntnis der kinetischen Parameter eines Enzyms ist eine wichtige Voraussetzung für die Etablierung eines Enzymtest ó also für die Bestimmung einer unbekannten Enzymmenge. Um sie zu bestimmen, wird die Umsatzgeschwindigkeit eines bestimmten Substrates gemessen. Mit bekannter Maximalgeschwindigkeit kann dann auf die Konzentration des Enzyms geschlossen werden. Es ist unabdingbar, daß das Enzym mit Substrat gesättigt ist, damit die (konstante) Maximalgeschwindigkeit erreicht werden kann. Dann ist die Geschwindigkeit der Enzymkonzentration direkt proportional (Diagramm 11). Über die nötige Substratkonzentration gibt der K_m-Wert Auskunft. Aus diesem Grund müssen diese Parameter vor jedem Enzymtest bestimmt werden.

Aufgabe 1)

Mit Hilfe eine Eichkurve wird nach Bradford die Enzymkonzentration der Chymotrypsin-Stammlösung über vier verschieden stark verdünnte Probelösungen bestimmt. Als Farbstoff wird Coomassie Brilliant Blue G-250 benutzt und nach 5 Minuten Inkubationszeit die Extinktion bei 595 nm gemessen.

(Verdünnungsreihe siehe Versuchsbeschreibung).

Die Molmasse von Chymotrypsin beträgt ca. 25000 g/mol. Damit sind in einem Milliliter der "Chymo-Standard"-Lösung (Konzentration 200 m g / ml) 8 nmol enthalten.

Es ergibt sich folgende Stoffmengenverteilung auf die verschiedenen Ansätze:
 

Ansatz Nr.	Volumen eingesetzter  Stammlösung in Mikrolitern	in 1,1 ml Standardlösung  enthaltene Stoffmenge in nmol
Standard 1	0	0
Standard 2	10	0,08
Standard 3	20	0,16
Standard 4	30	0,24
Standard 5	40	0,32
Standard 6	50	0,4

Diagramm 1

Aus der Ausgleichsgeraden läßt sich die zugehörige Geradengleichung ablesen, mit deren Hilfe man von den gemessenen Extinktionen der Probenlösungen auf die enthaltenen Stoffmengen zurückrechnen kann.

Geradengleichung der Ausgleichsgeraden:

Der Mittelwert für die Konzentration der Lösung "Chymo-Kinetik" ist damit 6,6125 mg/ml, das entspricht 264500 nmol/l. Dieses Ergebnis liegt im Bereich der erwarteten Konzentration, die mit ca. 6 mg/ml angegeben wurde.

Aufgabe 2)

Um den K_m-Wert und die maximale Anfangsgeschwindigkeit bei der Hydrolyse von Essigsäure-p-Nitro-Phenol durch Chymotrypsin zu bestimmen, wird die Substratabhängigkeit der Anfangsgeschwindigkeit durch Extinkionsmessung bei 405 nm bestimmt. Der Versuch wird zweimal durchgeführt. Die lineare Zeitabhängigkeit der Anfangsgeschwindigkeit bei spontaner Hydrolyse wird ebenfalls gemessen. Dazu werden sechs verschieden stark konzentrierte PNPA-Lösungen nach folgender Verdünnungsreihe hergestellt:

Stammlösung 0,75M
 

Volumen Stammlösung in m l	Volumen Dioxan in m l	Erreichte Konzentration in mmol/l
20	730	20

Aus diesem Ansatz 1 werden die folgenden Verdünnungen hergestellt:
 

Volumen Ansatz 1 in m l	Volumen Dioxan in m l	Erreichte Konzentration in mmol/l
100	100	10
50	150	5
20	180	2
10	190	1
5	195	0,5

Substratabhängigkeit 1

Diagramm 2:
 

Konzentration des Ansatzes	Steigung der Ausgleichsgeraden (1/s)	Volumenaktivität D c/min in m mol/(2ml.min)	Anfangsgeschwindig-keit D n/t in m mol/min
20 mM	7,07937E-4	2,360E-03	4,7196E-03
10 mM	5,90476E-4	1,968E-03	3,9365E-03
5 mM	4,7619E-4	1,587E-03	3,1746E-03
2 mM	4,39683E-4	1,466E-03	2,9312E-03
1 mM	3,44444E-4	1,148E-03	2,2963E-03
0,5 mM	2,55556E-4	8,519E-04	1,7037E-03

 

Substratabhängigkeit II
 
 

 
 
 

Konzentration des Ansatzes	Steigung der Ausgleichsgeraden (1/s)	Volumenaktivität D c/min in m mol/(2ml.min)	Anfangsgeschwindig-keit D n/t in m mol/min
20 mM	7,19048E-4	2,397E-03	4,794E-03
10 mM	5,99206E-4	1,997E-03	3,995E-03
5 mM	5,53175E-4	1,844E-03	3,688E-03
2 mM	4,65079E-4	1,550E-03	3,101E-03
1 mM	3,84127E-4	1,280E-03	2,561E-03
0,5 mM	2,66667E-4	8,889E-04	1,778E-03

Spontanhydrolyse:
 
 

Aus diesem Diagramm läßt sich ablesen, daß die Anfangsgeschwindigkeit der Spontanhydrolyse des Essigsäure-p-Nitro-Phenylesters für jede Konzentration einen speziellen konstanten Wert aufweist. (Das gilt nur für den Beginn der Reaktion, da bei längerer Beobachtungsdauer die Substratkonzentration sinkt und das E/t ó Diagramm in eine für eine Reaktion erster Ordnung typische Exponentialkurve übergeht. Dann ist die Steigung und damit die Geschwindigkeit keine Konstante mehr.)
 

Konzentration des Ansatzes	Steigung der Ausgleichs-geraden (1/s)	Volumenaktivität D c/min in m mol/(2ml.min)	Anfangsgeschwindig-keit D n/t in m mol/min
20 mM	1,78346E-4	5,945E-04	1,189E-03
10 mM	1,00902E-4	3,363E-04	6,727E-04
5 mM	4,67168E-5	1,557E-04	3,114E-04
2 mM	2,44612E-5	8,154E-05	1,631E-04
1 mM	8,17043E-6	2,723E-05	5,447E-05
1 mM	1,97995E-5	6,600E-05	1,320E-04
0,5 mM	4,21053E-6	1,404E-05	2,807E-05

Aus diesen drei Diagrammen läßt sich die Steigung ablesen. Sie entspricht dem Quotienten  . Um die Geschwindigkeit zu erhalten, muß die Extinktion über das Lambert-Beersche Gesetz in Konzentrationen bzw. mit bekanntem Volumen in Stoffmengen umgrechnet werden. Die Formel dafür lautet:

Da aus Aufgabe 2 ersichtlich ist, daß die zweite, zusätzliche Messung bei 1 mM Lösung ein verfälschtes Ergebnis liefert, wurde im folgenden nur mit dem Ergebnis der ersten Messung weitergerechnet.
 

Substratkonzentration in der Küvette in nmol/l	Anfangsgeschwindigkeit in nmol/min
250000	1,189
125000	0,673
62500	0,311
25000	0,163
12500	0,054
6250	0,132

 

Diagramm 5

Die Meßwerte liegen zeigen nur eine geringe Abweichung von einem linearen Verlauf und einen Korrelationskoeffizienten von 0,995. Dieses Diagramm zeigt die Proportionalität zwischen Anfangsgeschwindigkeit und Substratkonzentration für die spontane Hydrolyse. Damit läßt sich jeder Substratkonzentration eine spontane Anfangsgeschwindigkeit zuordnen, um die die enzymatisch katalysierte Messung korrigiert werden muß.

Substratabhängigkeit: 1. Messung
 

Konzentration des Substrates in der Küvette in nmol/l	Geschwindigkeit (nmol/min)	Um Spontanhydrolse korrigierte Anfangsgeschwindgkeit in nmol/l
250000	4,720	3,531
125000	3,937	3,264
62500	3,175	2,863
25000	2,931	2,768
12500	2,296	2,242
6250	1,704	1,676

 
 
 

Substratabhängigkeit: 2. Messung
 

Konzentration des Substrates in der Küvette in nmol/l	Geschwindigkeit (nmol/min)	Um Spontanhydrolse korrigierte Anfangsgeschwindgkeit in nmol/l
250000	4,794	3,605
125000	3,995	3,322
62500	3,688	3,376
25000	3,101	2,937
12500	2,561	2,506
6250	1,778	1,750

 

Diagramm 6

Dieses Diagramm zeigt für beide Meßreihen den typischen Verlauf einer Sättigungskurve.

Aufgabe 4)

Messung 1
 

1/Substratkonzentration in l/nmol	1/Anfangsgeschwindigkeit in min/nmol
4,00E-06	3,147
8,00E-06	3,404
1,60E-05	3,881
4,00E-05	4,014
8,00E-05	4,956
1,60E-04	6,631

Messung 2
 

1/Substratkonzentration in l/nmol	1/Anfangsgeschwindigkeit in min/nmol
4,00E-06	3,082
8,00E-06	3,345
1,60E-05	3,291
4,00E-05	3,783
8,00E-05	4,433
1,60E-04	6,350

Die nach Lineweaver-Burk umgestellte Michaelis-Menten-Gleichung lautet:

Lineweaver-Burk-Diagramm (7)

Aufgabe 5

Aus der nach Lineweaver und Burk linearisierten Michaelis-Menten-Gleichung lassen sich K_m und v_max als reziproker x-Achsenabschnitt bzw. reziproker y-Achsenabschnitt bestimmen.

Messung 1

Y = A + B * X

Parameter Value Error

------------------------------------------------------------

A 0,24342 0,01625

B 2219,06724 216,02772

------------------------------------------------------------

Messung 2

Y = A + B * X

Parameter Value Error

------------------------------------------------------------

A 0,22573 0,00887

B 2112,43931 117,93219

------------------------------------------------------------

Der Parameter A entspricht . Um K_m zu ermitteln muß für Y Null eingesetzt werden.
 

	Km in nmol/l	vmax in nmol/min
Messung 1	9116,2	4,108
Messung 2	9358,3	4,430

 

Aufgabe 6)

Nach der Michaelis-Menten Gleichung ergibt sich v_max = k_kat^. [E]. k_kat entspricht bei Substratsättigung der Wechselzahl (turnover number). k_kat gibt an, wie viele Substratmolküle in einer gegebenen Zeiteinheit von einem einzigen Enzymmolekül in das entsprechende Produkt umgesetzt werden.

Die Enzymkonzentration war bei den bisher ausgewerteten Versuchen stets gleich. Es wurden 25 m l Enzymlösung "Chymo-Kinetik" zugegeben, das entspricht einer Stoffmenge von 6,6125 nmol in 2 ml. (Damit lag eine Konzentration von [E]= 3306,25 nmol/l vor.) Mit den berechneten Werten für v_max kann die Wechselzahl bestimmt werden. Da die Geschwindigkeit auf eine Stoffmenge bezogen worden ist, wird hier ebenfalls die Enzymmenge eingesetzt:
 

vmax in nmol/min	Wechselzahl in s-1	1 U entspricht	Spezifische Aktivität in U/mg
4,108	0,0103	1,613 m mol	0,025
4,430	0,0112	1,493 m mol	0,026

Die Aktivität gibt an, welche Enzymmenge nötig ist, um ein m mol Substrat in der Minute umzusetzen. Diese Enzymmenge wird mit (U)nit benannt.

Aufgabe 7

Mit diesem Versuch überprüfen wir die Proportionalität zwischen Enzymkonzentration und Anfangsgeschwindigkeit im Sättigungsbreich, wie sie für einen etablierten Enzymtest gefordert ist. Sie ergibt sich auch aus der Michaelis-Menten-Gleichung, da bei großen Substratkonzentrationen K_m vernachlässigt werden kann.

Aus der Enzym-Stammlösung wurden 5 verdünnte Lösungen hergestellt, außerdem wurde eine Messung ohne Enzym durchgeführt (Ansatz 6). (Siehe Tabelle 1.1, Versuch 1-16).

Die Durchführung der Messung erfolgte analog der vorangegangenen Messung der Substratabhängigkeit und ebenfalls zweimal.

Messung 1:

Diagramm 8

Y = A + B * X

Ansatz 1

Parameter Value

A 0,11179 3,41835E-4

B 6,42063E-4 4,51289E-6
 
 

Ansatz 2

Parameter Value

------------------------------------------------------------

A 0,16136 3,40068E-4

B 0,00114 4,48957E-6

Ansatz 3

Parameter Value

------------------------------------------------------------

A 0,19061 2,55051E-4

B 0,00158 3,36718E-6

Ansatz 4

Parameter Value

------------------------------------------------------------

A 0,24543 0,00186

B 0,0021 2,45904E-5

Ansatz 5

Parameter Value

------------------------------------------------------------

A 0,28714 6,73014E-4

B 0,00255 8,88511E-6
 
 

Messung 2:

Diagramm 9

Ansatz 1

Y = A + B * X

Parameter Value

------------------------------------------------------------

A 0,12414 3,75425E-4

B 6,7381E-4 4,95635E-6
 
 

Ansatz 2

Parameter Value

------------------------------------------------------------

A 0,15418 5,06547E-4

B 0,00119 6,68742E-6
 
 

Ansatz 3

Parameter Value

------------------------------------------------------------

A 0,19257 0,00122

B 0,00168 1,60571E-5

Ansatz 4

Parameter Value

------------------------------------------------------------

A 0,24643 8,5863E-4

B 0,00214 1,13356E-5

Ansatz 5

Parameter Value

------------------------------------------------------------

A 0,28643 0,00128

B 0,00263 1,90178E-5
 
 
 
 

Diagramm 10
 
 

Ansatz 6 (=Spontanhydrolyse)

Y = A + B * X

1. Messung

Parameter Value

------------------------------------------------------------

A 0,05821 4,29315E-4

B 1,35714E-4 5,6678E-6

2. Messung

Parameter Value

------------------------------------------------------------

A 0,06604 7,83818E-4

B 1,47619E-4 1,03479E-5
 

Ansatz	Steigung (1/s))	Volumenaktivität D c/min in m mol/(2ml.min)	Anfangsgeschwindigkeit D n/t in m mol/min	um die Spontanhydrolyse korrigierte Geschwindigkeit (nmol/min)
1 (I)	6,42E-04	2,140E-03	4,280E-03	3,336
1 (II)	6,74E-04	2,246E-03	4,492E-03	3,548
2 (I)	0,00114	3,800E-03	7,600E-03	6,656
2 (II)	0,00119	3,967E-03	7,933E-03	6,989
3 (I)	0,00158	5,267E-03	1,053E-02	9,589
3 (II)	0,00168	5,600E-03	1,120E-02	10,26
4 (I)	0,0021	7,000E-03	1,400E-02	13,06
4 (II)	0,00214	7,133E-03	1,427E-02	13,32
5 (I)	0,00255	8,500E-03	1,700E-02	16,06
5 (II)	0,00263	8,767E-03	1,753E-02	16,59
6 (I)	1,36E-04	4,524E-04	9,048E-04
6(II)	1,48E-04	4,921E-04	9,841E-04

Mittelwert der Spontanhydrolysengeschwindigkeiten: 0,085 nmol/min
 

Ansatz-Nr	Enzymstoffmenge in der Küvette in nmol
1	6,6125
2	13,225
3	19,8375
4	26,45
5	33,0625
6	0

Diagramm 11

Die beiden Ursprungsgeraden sind fast deckungsgleich und zeigen einen sehr guten Korrelationskoeffizienten. Deutlich ist die Proportionalität zwischen Enzymmenge und Anfangsgeschwindigkeit zu erkennen, wie sie für einen aussagekräftigen Enzymtest notwendig ist.

1. Messung

Parameter Value Error

------------------------------------------------------------

A 0,1846 0,14186

B 0,48169 0,00647

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0,99973 0,13526 5 <0.0001

------------------------------------------------------------
 
 

2. Messung

Y = A + B * X

Parameter Value Error

------------------------------------------------------------

A 0,4169 0,12009

B 0,49021 0,00548

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0,99981 0,1145 5 <0.0001

------------------------------------------------------------

Fehlerbetrachtung:

Die Ergebnisse bestätigen die Erwartungen in allen Punkten. Sowohl die Enzymabhängigkeit bei Substratsättigung als auch die lineare Zeitabhängigkeit der Spontanhydrolyse konnten bestätigt werden. Damit sind die Bedingungen für einen Enzymtest erfüllt.

Die Abweichung der Meßwerte von den zu erwarteten Befunden läßt sich auf verschiedene Faktoren zurückführen:

• Pipettierfehler
• Schlechtes Mischen der Lösungen bei Verdünnungsreihen
• Schlechtes Umschütteln vor dem Einfüllen in die Küvette
• Abweichungen der Finn-Pipetten
• Meßungenauigkeit des Photometers
• Verunreinigungen der Lösungen
• Verdampfen des Lösungsmittels Dioxan und daraus resultierende Konzentrationserhöhungen