Thomas Sandmann

Dirk Hockemeyer
 
 

1. Proteinbestimmung nach Bradford

 

 

Protein-Stoffmenge der Standards in nmol	Extinktion
0	0
0,12	0,108
0,24	0,188
0,36	0,247
0,48	0,274
0,6	0,278

Obwohl die Gerade bei höheren Stoffmengen stark abknickt, wurde der letzte Wert nicht unberücksichtigt gelassen, da die Extinktionen der Enzymlösungen in diesem Bereich liegen. Offensichtlich ist diese Bradford-Enzymbestimmung bei den Konzentrationen, die in unserem Versuch verwendet werden, nicht aussagekräftig.
 
 
 
 
 
 

Die Eichgerade liefert folgende Geradengleichung, über die die Proteinmenge der Zentrifugate und der Referenzlösungen bestimmt werden kann:
 




Extinktion = 0,4636 ^. Proteinmenge (nmol) + 0,04343


 

Ansatz	Extinktion	Stoffmenge in nmol/10 m l	Stoffmenge in nmol/200 m l
Referenz (=Ansatz 2 1:1000)	0,152	0,234	-
Referenz (=Ansatz 2 1:2000)	0,2605	0,468	-
Z1	0,276	0,502	10,04
Z2	0,301	0,556	11,12
Z3	0,272	0,493	9,86
Z6	0,263	0,474	9,48
Z7	0,282	0,515	10,3

2. Auswertung der gemessenen Radioaktivität

	CPM	um Leerwert korrigierte cpm
Z 1	110,73	76,73
Z 2	1370,16	1336,16
Z 3	1364,17	1330,17
Z 6	113,48	79,48
Z 7	1093,68	1059,68
Referenz	52408,2	52374,2

Da das Meßergebnis von Z 6 offensichtlich durch falschen Ablesen oder Pipettierfehler verfälscht worden ist (11347,9 cpm) wird mit 113,48 cpm, einem realistischeren Wert, der um zwei Zehnerpotenzen niedriger ist, weitergerechnet.

Die gemessenen Ergebnisse stammen aus den verdünnten Zentrifugaten. Als erstes muß um die Hintergrundstrahlung des Meßraumes (34 cpm) korrigiert werden. Anschließend muß die Verdünnung zurückgerechnet der Zentrifugate (200 m l wurden auf 1 ml, bzw 2 ml mit Acetatpuffer aufgefüllt) werden.
 
 

Ansatz	Volumen der Meßprobe in ml	CPM nach 1. Zentrifugation bei pH5
Z1	0,6	255,51
Z2	0,6	4449,41
Z3	0,6	4429,47
Z6*	0,6	4439,44
Z7*	0,6	4439,44
Referenz	0,6	86941,17

* = Ansätze Z6 und Z7 vor der Zentrifugation

Die Werte für Z6 und Z7 sind sind nicht direkt zugänglich, da diese Ansätze aus Z4 und Z5 gebildet worden sind. Die Zentrifugate Z4 und Z5 sind genauso gebildet worden, wie Z2 und Z3, die beide ähnliche Ergebnisse zeigen. Deshalb kann davon ausgegangen werden, daß reproduzierbare Ergebnisse für die Radioaktivität nach der ersten Zentrifugation vorliegen. Für Z6 und Z7 wird der Mittelwert aus Z2 und Z3 angenommen.

Über die Referenzlösung, die nicht über eine Säule gelaufen ist, kann die Radioaktivität des Ansatzes 2 bestimmt werden. Um die Referenzlösung zu erhalten, wurde Ansatz 2 1:100 verdünnt.

	Cpm/ml
Ansatz 2	869976,12

Für die Ansätze Z2 und Z3 wurden je 200 m l des Ansatzes 2 benutzt. Das entspricht einer eingesetzten Radioaktivität von je 173995,22 cpm.

In Ansatz Z6 und Z7 wurde je die Hälfte der im Zentrifugat Z4 und Z5 enthaltenen Radioaktivität überführt. Das entspricht einer Aktivität von je 2219,72 cpm.

Sowohl Ansatz Z6 als auch Ansatz Z7 werden zentrifugiert. Bei Z6 wird der pH-Wert mit "Tris-Puffer" auf 8 erhöht. Bei Z7 bleibt der pH von 5 bestehen. Bei pH 8, dem pH-Optimum des Chymotrypsins, wird das bei der Spaltung von pNPA gebundene Acetat frei, bei pH 5 nicht. Deshalb betrachten wir Z7 als Vergleichsprobe zu Z6. Die Aktivität, die nach der ersten Zentrifugation noch vorliegt, stammt vor allem aus im Chymotrypsin gebundenem Acetat, da freies Acetat und freies pNPA von der Säule zurückgehalten worden sind. Daß die Radioaktivität nach dem Zentrifugieren von Z7 im Vergleich mit Z7* abgenommen hat, zeigt, daß auch ohne Hydrolyse ein Teil der Radioaktivität in der Säule zurückbleibt. Diesen Verlust (Z7*-Z7) = 460,65 cpm nehmen wir auch für die Zentrifugation von Z6* zu Z6 an. Die Differenz Z6*-Z6 wird deshalb um 460,65 cpm korrigiert.

	Z* in cpm	Z in cpm	Z*-Z in cpm	D Z6- D Z7 in cpm
Z 6	2219,72	131,9368	2087,78	1627,13
Z 7	2219,72	1759,0688	460,65

Diese Differenz gibt uns nun an, wieviel radioaktiv markiertes Acetat an Chymotrypsin bei pH 5 gebunden und durch die pH-Ÿnderung abgespalten worden ist.

Um aus der Aktivität auf die enthaltene ¹⁴C-Menge schließen zu können, nutzen wir die Referenzlösung, mit der wir das Verhältnis von gemessener Radioaktivität zu enthaltenem ¹⁴C angeben können.
 

	Stoffmenge an 14C in nmol	Gemessene Radioaktivität in cpm	Verhältnis Radioaktivität pro Stoffmenge 14C in cpm/nmol
Referenzlösung	200,00	86941,17	434,71
D Z6-D Z7 in cpm	3,74	1627,13

Damit ergibt, daß 3,74 nmol Acetat an Chymotrypsin gebunden war. Nun läßt sich das Verhältnis von ehemals gebundener Acetatmenge zu Proteinmenge bestimmen.

Aus der Proteinbestimmung wissen wir, daß 9,48 nmol in Z6 enthalten sind. Damit erhalten wir ein Verhältnis von ca. 0,4. Das bedeutet, daß vor dem hydrolytischen Säulendurchlauf 40% der Chymotrypsinmoleküle einen markierten Acetatrest gebunden hatten und jedes sein Acetat beim Säulendurchlauf abgespalten hat. (Im Zentrifugat ist fast keine Radioaktivität mehr meßbar.)
 

	Proteinmenge in nmol	Verhältnis C14/Chymotrypsin
D Z6-D Z7 in cpm	9,48	0,39

Berechnet man stattdessen direkt das Verhältnis von ¹⁴C in den Zentrifugaten zum Proteingehalt, nachdem man Z1 als Referenzwert ohne Bindungsaktivität des Chymotrypsins abgezogen hat, erhält man folgende Werte:
 

	Radioaktivität am Ende in cpm	Um Z1 korrigierte cpm	entsprechende 14C-Menge in nmol	enthaltenes Protein in nmol/200 m l	Verhältnis 14C/Protein
Z 1	255,51	0	0,00	10,04	0,00
Z 2	4449,41	4193,90	9,65	11,12	0,87
Z 3	4429,4661	4173,96	9,60	9,86	0,97
Z 6	131,9368	0,00	0,00	9,48	0,00
Z 7	1759,069	1503,558	3,46	10,30	0,34

Der Wert für Z7 weicht stark von den zu Z2 und Z3 gehörigen ab. Diese beiden Zentrifugate haben nur einen Säulendurchlauf absolviert. Das Verhältnis von radioaktiv markierten Molekülen zu Protein ist annähernd 1:1. Nach dem 2. Säulendurchlauf durch Säule 7, in der auch keine Hydrolyse ermöglicht worden ist, ist das Verhältnis viel geringer. Das läßt sich u.U. mit erst jetzt abgetrennten radioaktivem pNPA erklären.

Das Verhältnis nach dem Säulendurchlauf von Z7 dagegen läßt sich wahrscheinlich aufsschließlich auf Chymotrypsin zurückführen, das radioaktives Acetat gebunden hat. Dieses Verhältnis bestätigt die Messung von Z6 (s.o.), die ebenfalls ein Verhältnis von ca. 35-40% Chymotrypsin mit gebundenem Acetet ergeben hat.

Da das Meßergebnis von Z 6 offensichtlich durch falschen Ablesen oder Pipettierfehler verfälscht worden ist (11347,9 cpm) wird mit 113,48 cpm, einem realistischeren Wert, der um zwei Zehnerpotenzen niedriger ist, weitergerechnet.
 




Radioaktivitätsbilanz


 




1. Ergebnis der Wischtests:

	cpm
Arbeitsplatte (Filter)	46,88
Pipette 5-40 m l	38,9
Pipette 40-200 m l	39,9
Pipette 100-1000 m l	40,9
Flüssiger Abfall (200 m l)	1446,09

2. Bilanz:


Volumen des flüssigen Abfalls: 110 ml
 




Flüssiger Abfall: 795349,5 cpm


 




+ Szintilationsgefäße: 99510,16 cpm

894859,66 cpm

Ausgegebene Radioaktivität: 1155756 cpm

Damit liegen 77,4 % der ausgegebenen Radioaktivität in flüssiger Form vor. Auf den Festabfall entfallen somit 22,6 % oder 261200,86 cpm.

3. Umrechnung in dpm

Für den radioaktiven Zerfall gilt das Geschwindigkeitsgesetz 1. Ordnung:
 

Mit der Halbwertszeit von 5730 Jahren läßt sich die Zerfallsrate pro Minute bestimmen (dpm). Der Unterschied der theoretisch erwarteten Zerfallsrate und der gemessenen Rate läßt sich sich auf die Eigenschaften des Meßgerätes zurückführen und wird mit der Zählrate charakterisiert. Nun können wir die gemessenen cpm des Abfalls in dpm umrechenen. Um diese in kilo-Bequerel anzugeben, muß noch durch 60000 geteilt werden, um sie auf eine Minute zu beziehen.