Praktikanten:

Thomas Sandmann

Dirk Hockemeyer
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Protokoll zu Versuchstag 7:
 

Die Reaktion von b -adrenergen Rezeptoren auf unterschiedliche Wirkstoffe wird anhand der cAMP-Bildung in Gliomzellen untersucht.

Die cAMP-Konzentration wird mit Hilfe einer Isotopenverdünnung (³H-cAMP) bestimmt. Als Bindungsprotein für "kaltes" und "heißes" cAMP wird eine cAMP-abhängige Proteinkinase aus Rinderherz verwandt.

Die gemessenen cAMP-Konzentrationen werden anschließend auf die Zahl der lebenden Zellen in einer Kulturschale und die enthaltene Proteinmenge bezogen und ausgewertet.
 
 

1. cAMP-Bestimmung


Zur Auswertung werden zunächst die Mittelwerte der Zählergebnisse für die Mehrfachbestimmung berechnet.

Zählergebnisse für die Isotopen-Verdünnungs-Ausgleichsgerade:

(Der Raumleerwert beträgt 34 cpm.)

Gefäß Nr.	cpm	um Raum-Leerwert korrigierte cpm
1	166	132
3	6013	5979
5	6830	6796
7	1923	1889
9	1166	1132
11	646	612
13	376	342
15	305	271
17	387	353

Gefäß Nr.	cpm	um Raum-Leerwert korrigierte cpm
2	44	10
4	6554	6520
6	1800	1766
8	1307	1273
10	623	589
12	471	437
14	274	240
16	385	351


 

Damit erhält man folgende Mittelwerte, da stets zwei gleiche Ansätze gemessen worden sind:
 

Gefäße	Mittelwerte der um den Raumleerwert korrigierten cpm	Um Filterleerwert korrigierte cpm (B)
1,2	71	0
3,4,5	6432	6361 (B0)
6,7	1827	1756
8,9	1203	1131
10,11	601	530
12,13	389	318
14,15	255	184
16,17	352	281

In den ersten beiden Ansätzen war kein Bindungsprotein enthalten, das im Filter gemessen ³H ist also ungebunden. Dieser Wert wird deshalb als Filterleerwert von den anderen Mittelwerten abgezogen (rechte Spalte).

Mit diesen Werten wird nun ein abgewandelter Scatchard-Plot erstellt. Die Ansätze 3,4 und 5 enthalten kein "kaltes" cAMP und geben deshalb Auskunft über die maximale Bindung (B₀).

Es wird der Quotient B₀/B gegen die (kalte) cAMP-Konzentration aufgetragen.

B₀= Mittelwert der maximal gebundenen Radioaktivität in cpm

B = Mittelwert der gebundenen Radioaktivität in Anwesenheit definierter cAMP-

Mengen

Die Ausgleichsgerade hat folgende Gleichung:
 




B₀/B = 0,4 + 1,1 ^. [cAMP]


 




Damit läßt sich nun die cAMP-Konzentration in den Meßproben (Ansätze 18-32) bestimmen.

Wieder werden zunächst die Zählergebnisse gemittel und korrigiert.
 

Gefäß Nr.	cpm	um Raum-Leerwert korrigierte cpm	um Filterleerwert und Raumleerwert korrigierte cpm (B)
18	262	228	157
19	1697	1663	1592
20	1917	1883	1812
21	2379	2345	2274
22	2244	2210	2139
23	3795	3761	3690
24	4275	4241	4170
25	5336	5302	5231
26	6495	6461	6390
27	5510	5476	5405
28	5915	5881	5810
29	424	390	319
30	169	135	64
31	1755	1721	1650
32	2279	2245	2174

Mit der umgestellten Geradengleichung erhalten wir folgende cAMP-Konzentrationen:

Gefäß Nr.	B0/B	cAMP-Stoffmenge [pmol]
18	40,63	36,7
19	4,00	3,3
20	3,51	2,9
21	2,80	2,2
22	2,97	2,4
23	1,72	1,3
24	1,53	1,1
25	1,22	0,8
26	1,00	0,6
27	1,18	0,8
28	1,09	0,7
29	19,92	17,8
30	99,46	90,3
31	3,85	3,2
32	2,93	2,4

2. Normierung der gefundenen cAMP-Werte


a) Zellzahlbestimmung

Das Volumen des ausgezählten Flüssigkeitsquaders in der Zählkammer wird berechnet.
 

Volumen des Flüssigkeitsquaders m l	Zahl der lebenden Zellen im ausgezählten Bereich	Zahl der toten Zellen im ausgezählten Bereich
0,1	454	5

Der ausgezählte Bereich bestand aus 16 Einzelflächen. Damit läßt sich auf die Gesamtzahl der lebenden bzw. toten Zellen in der Kulturschale unter Berücksichtigung aller Verdünnungsschritte (auch der 1:2-Verdünnung bei Farbstoffzugabe) hochrechnen.

Die Zellsuspension wurde in 1 ml HEPES-Puffer aufgenommen.

Damit erhalten wir folgende Ergebnisse:

Gesamtzellzahl lebend	Gesamtzellzahl tot
9080000	100000

b) Proteinbestimmung

Folgende Meßwerte wurden aufgenommen:

Gefäß Nr.	Proteinmenge [m g]	Extinktion	Mittelwerte der Extinktion
1	0	0	-0,0025
2	0	-0,005
3	10	0,149	0,155
4	10	0,161
5	20	0,307	0,309
6	20	0,311
7	40	0,564	0,566
8	40	0,568
9	60	0,738	0,7325
10	60	0,727
11	80	0,971	0,959
12	80	0,947


 
 
 

Diese Ergebnisse werden als Eichgerade aufgetragen:

Die Geradengleichung
 




Extinktion = 0,04 + 0,012 ^. Proteinmenge


 




kann nun dazu benutzt werden, die Proteinmenge unserer Ansätze zu bestimmen.
 

Gefäß Nr.	Extinktion	Mittelwerte der Extinktionen (13,14; 15,16)	Proteinmenge [m g]	Proteinmenge in der Kulturschale (m g)
13	0,372	0,36	27,1	2166,9
14	0,348
15	0,689	0,6745	53,8	2153,2
16	0,66

Mittelwert der Proteinmenge in der Kulturschale: 2160,1 m g
 
 

c) Bezug der cAMP-Werte auf die Zellzahl und die Proteinmenge

Gefäß Nr.	cAMP-Stoffmenge [pmol]	cAMP [pmol/106 Zellen)	cAMP pro Zellprotein [pmol/mg]
18	2039,5	224,6	944,2
19	18,5	2,0	8,6
20	16,0	1,8	7,4
21	12,4	1,4	5,7
22	13,3	1,5	6,2
23	7,0	0,8	3,2
24	6,0	0,7	2,8
25	22,0	2,4	10,2
26	16,4	1,8	7,6
27	21,0	2,3	9,7
28	18,9	2,1	8,8
29	495,6	54,6	229,5
30	2509,1	276,3	1161,6
31	17,8	2,0	8,2
32	13,1	1,4	6,0

Konzentrations-Wirkungskurven
 
 

Wertetabelle:

Gefäß Nr.	Konzentration Isoproterenol [M]	cAMP [pmol/106 Zellen]	Zusätze
18	1,00E-06	224,6	IBMX 10-4 M
19	1,00E-09	2,0
20	1,00E-09	1,8
21	1,00E-08	1,4
22	1,00E-08	1,5
23	3,00E-08	0,8
24	3,00E-08	0,7
25	1,00E-07	2,4
26	1,00E-07	1,8
27	3,00E-07	2,3
28	3,00E-07	2,1
29	1,00E-06	54,6
30	1,00E-06	276,3
31	1,00E-06	2,0	Propranolol 10-6 M
32	0	1,4	Leerwert


 

Obwohl in Gefäß Nr. 29 und Nr. 30 die gleiche Wirkstoffkonzentration vorliegen sollte, weichen die Werte sehr stark voneinander ab. Wahrscheinlich liegt ein Meßfehler oder ein Fehler bei der Inkubationszeit vor. In der Auswertung wird dennoch ein Mittelwert aus beiden Meßwerten betrachtet.

3. Auswertung

Betrachtet man die Konzentrationswirkungskurven so wird deutlich, daß erst bei Übersteigen einer gewissen Agonistenkonzentration (Isoproterenol, ca. 10^-6 M) eine Zellreaktion ausgelöst wird. Es liegt ein Schwellenwert vor. Die Zugabe eines Phosphpdiesterasehemmstoffes (IBMX) verstärkt die Zellantwort, da entstandenes cAMP nicht mehr abgebaut wird, sondern sich anhäuft. Wird ein Antagonist (Propranolol) zugegeben, der einen kompetetiven Hemmstoff darstellt, da er zwar an den Rezeptor bindet, aber keine Signalweiterleitung auslöst, wird auch bei Überschreitung des normalen Schwellenwertes keine Zellantwort ausgelöst.



3. Radioaktivitätsbilanz

Da die Ausgabe der Radioaktivtät Zehn Stunden vor der Messung der Wischtests erfolgte, muß miteinberechnet werden, daß ein "natürlicher" Verlust durch Abklingen aufgetreten ist.
 

Leerwert in CPM	ausgebene Radioaktivität cpm	vergangene Zeit in Minuten	cpm beim Versuchsende	abgeklungene Radioaktivität %
34	872100	600	872043	0,006

Ergebnisse der Wischtests / des Flüssigkeitsabfalls:
 

	cpm	um Leerwert korrigierte cpm
Flüssigkeitsabfall (600 m l)	1173,79	1140
200er Pipette	17	0
40er Pipette	16,1	0
Tisch	19,27	0

Auswertung:
 

Gesamtvolumen Flüssigkeitsabfall m l	Gesamte Radioaktivität cpm	Anteil an der ausgegebenen Radioaktivität %
336400	639042	73,3

 

Damit können wir den Verbleib von 81,8% der ausgegebenen Radioaktivität angeben. Die übrige Radioaktivität befindet sich demnach im festen Abfall.