Prole viável derivada de células de mamífero adultas e fetais

Nature, vol. 385, pag.810 - 813, 27/Fevereiro/1997

I. Wilmut, A. E. Schnieke*, J. McWhir, A. J. Kind* & K. H. S. Campbell

Roslin Institute (Edinburgh), Roslin, Midlothian EH25 9PS, UK * PPL Therapeutics, Roslin, Midlothian EH25 9PP, UK

A fertilização de ovos de mamíferos é seguida de sucessivas divisões celulares e progressiva diferenciação, primeiramente em um embrião simples e subseqüentemente em todos os tipos celulares que formam um animal adulto. A transferência de um núcleo em um estágio específico de desenvolvimento para um ovo não-fertilizado e enucleado (retirou-se-lhe o núcleo) forneceu uma oportunidade de investigar se a diferenciação celular até aquele estágio envolveu modificação genética irreversível. A primeira prole a se desenvolver a partir de uma célula diferenciada nasceu após transferência nuclear de uma linhagem celular derivada de embrião que fora induzida a se tornar quiescente (dormente)¹. Usando o mesmo procedimento, reportamos agora o nascimento de cordeiros vivos a partir de três novas populações celulares, de glândula mamária, feto e embrião. O fato de um cordeiro ter sido derivado de uma célula adulta confirma que a diferenciação daquela célula não envolveu modificação irreversível do material genético para que a diferenciação de completasse. O nascimento de cordeiros a partir de células diferenciadas de feto e de adulto também reforça a especulação prévia^1,2 de que com a indução de dormência das células doadoras (do núcleo) seria possível obter-se desenvolvimento normal a partir de uma larga variedade células diferenciadas.

Há muito tempo se sabe que, em anfíbios, núcleos transferidos de queratócitos adultos estabelecidos em cultura possibilitam o desenvolvimento até o estágio jovem, de girino³. Embora isso envolva diferenciação de tecidos e órgãos complexos, não de reportou desenvolvimento até o estágio adulto, deixando em aberto a questão de se um núcleo adulto diferenciado pode ser totalmente reprogramado. Previamente, reportamos o nascimento de cordeiros vivos após transferência do núcleo de células embrionárias em cultura que foram induzidas à quiescência. Sugerimos que induzir a célula doadora a sair da fase de crescimento causa mudanças na estrutura da cromatina que facilitam a reprogramação da expressão gênica e que o desenvolvimento seria normal se núcleos de uma variedade de células doadoras diferenciadas fossem utilizados em regimes similares. Aqui investigamos se o desenvolvimento normal e total é possível quando as células doadoras derivadas de tecido adulto ou fetal são induzidas a sair do ciclo de crescimento e entrar na fase G₀ do ciclo celular antes da transferência nuclear. Três novas populações de células foram derivadas de:

1) um embrião de 9 dias;

2) um feto de 26 dias;

3) glândula mamária de uma ovelha de 6 anos de idade, no último trimestre de gravidez.

A morfologia das células derivadas de embrião (Fig. 1) é diferente tanto da de células germinativas de camundongo quanto da das células embrionárias utilizadas em nosso estudo anterior. A transferência nuclear foi feita de acordo com um de nossos protocolos estabelecidos¹ e os embriões reconstruídos (citoplasma de uma célula e núcleo de outra) foram transferidos para ovelhas receptoras. Exames de ultra-som detectaram 21 fetos nos dias entre 50 e 60 após o estro (Tabela 1). Em exames subseqüentes em intervalos de cerca de 14 dias, menos fetos foram observados, sugerindo ou diagnóstico errado ou perda de fetos. No total, 62% dos fetos foram perdidos, uma proporção significativamente maior que os estimados 6% após cruzamento natural⁴. Perda pré-natal aumentada tem sido reportada após manipulação embrionário ou cultura de embriões não-reconstruídos⁵. Por volta do dia 110 de gestação, quatro fetos estavam mortos, todos derivados das células embrionárias, e análise post mortem foi possível após matar as ovelhas. Dois fetos tinham desenvolvimento anormal do fígado, mas nenhuma outra anormalidade foi detectada e não houve evidência de infecção.

Figura 1 - Fotomicrografia de contraste de fase de populações de células doadoras: a, Células derivadas de embrião (SEC1); b, Fibroblastos fetais (BLWF1); c, Células derivadas de mama (OME). d, Análise de microsatélite de ovelhas receptoras, células doadoras de núcleo e cordeiros, utilizando-se quatro marcadores polimórficos de ovinos²². As ovelhas estão arranjadas da esquerda para a direita na mesma ordem dos cordeiros. Populações celulares são derivadas de embrião (SEC1), de feto (BLWF1) e de mama (OME), respectivamente. Os cordeiros tem o mesmo genótipo das células doadoras e diferente do de suas mães receptoras.

Tabela 1 - Desenvolvimento de embriões reconstruídos com três diferentes tipos celulares

Tipo celular	N^o de pares fundidos (%)*	N^o de recuperados de oviduto (%)	N^o cultivado	N^o de mórulas/ blastocistos (%)	N^o de mórulas ou blastocistos transferidos†	N^ode gestações/ N^o de receptoras (%)	N^o de cordeiros vivos (%)‡
Epitélio mamário	277 (63,8)^a	247 (89,2)	--	29 (11,7)^a	29	1/13 (7,7)	1 (3,4%)
Fibroblasto fetal	172 (84,7)^b	124 (86,7)	-- 24	34 (27,4)^b 13 (54,2)^b	34 6	4/10 (40,0) 1/6 (16,6) 2 (5,9%)	1 (16,6%)**
Derivada de embrião	385 (82,8)^b	231 (85,3)	-- 92	90 (39,0)b 36 (39,0)b	72 15	14/27 (51,8) 1/5 (20,0)	4 (5,6%) 0 *

Conforme calculado 1 h após fusão por exame em um microscópio de dissecção. Superescritos ^a ou ^b em uma coluna indicam uma diferença significante entre os tipos de célula doadora na eficiência de fusão (P<0,001) ou a proporção de embriões que se desenvolveram até mórula ou blastocisto (P<0,001).† Não foi possível transferir todas as mórulas/blastocistos.‡ Como proporção de mórulas ou blastocistos transferidos. Nem todos receptores estavam perfeitamente sincronizados.** Este cordeiro morreu poucos minutos após o nascimento.

Oito ovelhas deram a luz a cordeiros vivos (Tabela 1, Fig. 2). Todas as três populações celulares (embrião, feto e glândula mamária) estavam representados. Um cordeiro fraco, derivado de fibroblastos fetais, pesava 3,1 kg e morreu após poucos minutos do nascimento, embora análise post mortem tenha falhado em encontrar qualquer anormalidade ou infecção. Sendo 12,5%, a perda perinatal não foi muito diferente da que ocorre em grandes estudos comerciais com ovelhas, onde 8% dos cordeiros morrem até 24h depois de nascidos⁶. Em todos os casos os cordeiros mostraram as características morfológicas da raça utilizada para doar o núcleo e não as da raça doadora do oócito. Só isso já indica que os cordeiros não poderiam ter nascido de cruzamento inadvertido ou das doadoras dos oócitos ou das ovelhas receptoras. Além disso, a análise de quatro loci polimórficos do DNA de microsatélites das populações celulares e dos cordeiros confirmou que cada cordeiro foi derivado da população celular usada como doadora do núcleo. A duração da gestação é determinada pelo fenótipo do feto⁷, e em todos os casos a gestação foi mais longa do que a média para a raça em questão (Tabela 2). Diferentemente, o peso ao nascer é influenciado tanto pelo genótipo materno quanto fetal⁸. O peso ao nascer de todos os cordeiros estava dentro da faixa normal da raça para nascimento simples (não gêmeos) de cordeiros nascidos de ovelhas Blackface em nossa fazenda (até 6,6 kg) e, na maioria dos casos, estava dentro da faixa para a raça da doadora do núcleo. Não há observações controle estritas para o peso ao nascer após transferência de embriões entre raças, mas a faixa de peso para cordeiros nascidos de mães de mesma raça vai de 1,2--5,0 kg, 2,0--4,9 kg e 3,0--9,0 kg para os genótipos Finn Dorset, Welsh Mountain e Poll Dorset, respectivamente. A chegada à maturidade sexual nos cordeiros está sendo monitorada.

Figura 2 - Cordeiro número 6LL3 derivado de glândula mamária de uma ovelha Finn Dorset, junto da ovelha Scottish Blackface que foi sua receptora.

Tabela 2 - Parto de cordeiros desenvolvidos de embriões derivados de transferência nuclear de três tipos de células doadoras diferentes, mostrando duração da gestação e peso ao nascer

Tipo celular	Raça do cordeiro	Identidade do cordeiro	Duração da gestação (dias)*	Peso ao nascer (kg)
Epitélio mamário	Finn Dorset	6LL3	148	6,6
Fibroblasto fetal	Black Welsh Black Welsh Black Welsh	6LL7 6LL8 6LL9†	152 149 156	5,6 2,8 3,1
Derivada de embrião	Poll Dorset Poll Dorset Poll Dorset Poll Dorset	6LL1 6LL2‡ 6LL5 6LL6‡	149 152 148 152	6,5 6,2 4,2 5,3

* As médias das raças são 143, 147 e 145 dias, respectivamente para os genótipos de Finn Dorset, Black Welsh Mountain e Poll Dorset.† Esse cordeiro morreu poucos minutos após o nascimento.‡ Esses cordeiros sofreram parto por cesariana. No geral, a natureza da assistência provida pelo veterinário cirurgião foi similar à esperada em um rebanho comercial.

O desenvolvimento de embriões produzidos por transferência nuclear depende da manutenção da ploidia normal (neste caso, 2N) e da criação de condições para regulação, durante o desenvolvimento, da expressão gênica. Esses pontos são influenciados tanto pelo estágio do ciclo das células do doador e das células receptoras como pela interação entre elas (revisado na ref.9). Uma comparação entre o desenvolvimento de embriões de camundongo e o de embriões de gado produzidos por transferência nuclear para oócitos^10,11 ou zigotos enucleados^12,13 sugere que uma proporção maior deles de desenvolve se o receptor é um oócito. Isso pode ser assim porque fatores que levam à reprogramação da expressão gênica em um núcleo transferido são necessários para o desenvolvimento inicial e são absorvidos pelos pronúcleos durante o desenvolvimento do zigoto. Se o citoplasma da célula receptora é preparado por enucleação de um oócito em metáfase II, só é possível se evitar danos aos cromossomos e manter a ploidia normal com a transferência de núcleos diplóides^14,15, mas outros experimentos são necessários para se definir o melhor estágio do ciclo celular. Nossos estudos com células cultivadas sugerem que há uma vantagem se as células estão quiescentes (ref.1 e esse trabalho). Em estudos anteriores, células doadoras eram blastômeros embrionários que não haviam sido induzidos a entrar em quiescência. Comparações das fases do ciclo de crescimento mostraram que o desenvolvimento foi maior quando as células doadoras estavam em mitose16 ou na fase G₁ (ref.10) do ciclo, ao invés de estar nas fases S ou G₂. Desenvolvimento aumentado utilizando-se células doadoras em G₀, G₁ ou mitose pode refletir um maior acesso para os fatores de reprogramação presentes no citoplasma do oócito, mas uma comparação direta dessas fases na mesma população celular é necessária para uma compreensão mais clara dos mecanismos subjacentes. Juntos, esses resultados indicam que núcleos de uma larga variedade de tipos celulares poderia ser totipotente após se aumentarem as oportunidades para reprogramação utilizando-se combinações apropriadas desses estágios do ciclo celular. Por sua vez, a disseminação do melhoramento genético obtido em rebanhos “de elite” será aumentada pela replicação limitada de animais com comprovada performance, por meio de transferência nuclear de células derivadas de animais adultos. Além disso, a seleção de genes no rebanho agora deverá ser praticável por transferência nuclear a partir de populações celulares modificadas e oferecerá novas oportunidades em biotecnologia. As técnicas descrita também oferecem uma oportunidade de se estudar a possível persistência e impacto de mudanças epigenéticas, como a “gravação” (imprinting) e o encurtamento do telômero, que se sabe ocorrerem em células somáticas durante o desenvolvimento e a senescência (envelhecimento), respectivamente. O cordeiro nascido após transferência nuclear de célula de glândula mamária é, até onde sabemos, o primeiro mamífero a se desenvolver de uma célula derivada de um tecido adulto. O fenótipo da célula doadora é desconhecido. A cultura primária contém principalmente epitélio mamário (mais de 90%) assim como outros tipos de células diferenciadas, incluindo células mioepiteliais e fibroblastos. Não podemos excluir a possibilidade de que haja uma pequena proporção de células germinativas relativamente indiferenciadas capazes de propiciar regeneração da glândula mamária durante a gestação. O nascimento do cordeiro mostra que durante o desenvolvimento daquela célula mamária não houve modificação irreversível da informação genética necessária para o desenvolvimento total. Isso é consistente com a visão geralmente aceita de que a diferenciação de mamíferos é quase toda realizada por mudanças seqüenciais, sistemáticas na expressão gênica causadas pelas interações entre o núcleo e o ambiente citoplasmático em modificação¹⁷.

Métodos
Células derivadas de embrião foram obtidas de discos embrionários de um embrião com 9 dias de uma ovelha Poll Dorset, e cultivadas segundo descrito¹, com as seguintes modificações. Meio de cultura para células germinativas foi suplementado com DIA/LIF bovino. Após 8 dias, o disco explantado foi desagregado por digestão enzimática e as células foram re-plaqueadas em novas placas com alimentadoras. Após mais 7 dias, uma só colônia de células grandes e achatadas foi isolada e continuou a ser crescida, agora sem a presença das células alimentadoras. Na passagem 8, o número modal de cromossomos era 54. Essas células foram utilizadas como doadoras do núcleo nas passagens 7 a 9. Células derivadas de feto foram obtidas de um feto Black Welsh Mountain eviscerado recuperado de uma autópsia no dia 26 de gravidez. A cabeça foi removida antes de os tecidos serem cortados em pedaços pequenos e as células dispersadas por exposição a tripsina. A cultura foi feita em BHK 21 (Glasgow MEM, Gibco Life Sciences) suplementado com L-glutamina (2 mM), piruvato de sódio (1 mM) e 10% de soro fetal de bezerro. Com 90% de confluência as células foram diluídas 1:2. Na passagem 4, essas células semelhantes a fibroblastos (Fig. 1) tinham número modal de cromossomos igual a 54. As células fetais foram utilizadas como doadoras de núcleo nas passagens 4 a 6. As células de glândula mamária foram obtidas de uma ovelha Finn Dorset de 6 anos, no último trimestre de gravidez¹⁸. Nas passagens 3 e 6, o número modal de cromossomos era 54 e essas células foram utilizadas como doadoras de núcleo nas passagens 3 a 6.

A transferência nuclear foi feita de acordo com um protocolo prévio¹. Os oócitos foram recuperados de ovelhas Scottish Blackface entre 28 e 33 horas após injeção de hormônio liberador de gonadotropina (GnRH), e enucleados tão logo quanto possível. Eles foram recuperados em PBS (solução salina tamponada com fosfato) livre de magnésio e cálcio contendo 1% de FCS e transferidos para um meio de cultura M2 livre de cálcio 19 e contendo 10% de FCS a 37^oC. Células doadoras diplóides e quiescentes foram produzidas ao se reduzir a concentração de soro no meio de 10 para 0,5% por 5 dias, fazendo com que as células saíssem do ciclo de crescimento e parassem em G₀. Confirmação de que as células haviam deixado o ciclo foi obtida por coloração com anticorpo antiPCNA/ciclina (Immuno Concepts), revelada por um segundo conjugado de anticorpo com rodamina (Dakopatts).

Fusão da célula doadora com o oócito enucleado e ativação do oócito foram induzidas por alguns pulsos elétricos, entre 34 e 36 horas após injeção de GnRH nas ovelhas doadoras. A maioria dos embriões reconstruídos foi cultivada em ovidutos ligados de ovelha como anteriormente, mas alguns embriões produzidos por transferência de células derivadas de embrião ou de fibroblastos fetais foram cultivados em um meio quimicamente definido²⁰. A maioria dos embriões que se desenvolveram até mórula ou blastocisto após 6 dias de cultura foram transferidos para ovelhas receptoras e deixados em desenvolvimento até o final (Tabela 1). Um, dois ou três embriões foram transferidos para cada ovelha, dependendo da disponibilidade de embriões. O efeito do tipo celular (se proveniente de embrião, feto ou adulto) sobre fusão e desenvolvimento até mórula ou blastocisto foi analisado usando o modelo marginal de Breslow e Clayton²¹. Nenhuma comparação do desenvolvimento até o final foi possível, pois não era praticável transferir todos os embriões que se desenvolveram até um estágio adequado para a transferência. Quando havia muitos embriões disponíveis, foram selecionados os de melhor morfologia.

Exames de ultrassom foram utilizados para diagnóstico de gravidez cerca de 60 dias após o estro e para monitorar o desenvolvimento subseqüente a intervalos de 2 semanas. Ovelhas receptoras prenhes tiveram monitorados seus estados nutricionais, condições físicas e sinais de EAE, febre Q, border disease, mal de louping, e toxoplasmose. Conforme o nascimento se aproximava, elas ficaram sob constante observação e um cirurgião veterinário foi chamado no início do parto. Análise de microsatélite foi feita com o DNA dos cordeiros e das ovelhas receptoras utilizando-se quatro marcadores polimórficos de ovinos²².

Correspondência deve ser endereçada a: I.W. (e-mail: [email protected]).

Agradecemos a A. Colman por seu envolvimento durante esse experimento e por orientação durante a preparação desse manuscrito; C. Wilde pelas células derivadas de glândula mamária; M. Ritchie, J. Bracken, M. Malcolm-Smith, W.A. Ritchie, P. Ferrier e K. Mycock pela ajuda técnica; D. Waddington pela análise estatística; e H. Bowran e seus colegas pelo cuidado com os animais. Essa pesquisa foi mantida em parte graças ao Ministério da Agricultura, Pesca e Alimentos. Os experimentos foram conduzidos segundo a Animals (Scientific Procedures) Act 1986 (Ata de Procedimentos Científicos com Animais) e com a aprovação do Roslin Institute Animal Welfare (Instituto Roslin de Bem-estar Animal) and Experiments Committee (Comitê de Experimentos).

Referências
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2. Solter, D. Nature 380, 24--25 (1996).

3. Gurdon, J. B., Laskey, R. A. & Reeves, O. R. J. Embryol. Exp. Morph. 34, 93--112 (1975).

4. Quinlivan, T. D., Martin, C. A., Taylor, W. B. & Cairney, I. M. J. Reprod. Fert. 11, 379--390 (1966).

5. Walker, S. K., Heard, T. M. & Seamark, R. F. Therio 37, 111--126 (1992).

6. Nash, M. L., Hungerford, L. L., Nash, T. G. & Zinn, G. M. Vet. Rec. 139, 64--67 (1996).

7. Bradford, G. E., Hart, R., Quirke, J. F. & Land, R. B. J. Reprod. Fert. 30, 459--463 (1972).

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9. Campbell, K. H. S., Loi, P., Otaegui, P. J. & Wilmut, I. Rev. Reprod. 1, 40--46 (1996).

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12. McGrath, J. & Solter, D. Science 226, 1317--1318 (1984).

13. Robl, J. M. J. Anim. Sci. 64, 642--647 (1987).

14. Campbell, K. H. S., Ritchie, W. A. & Wilmut, I. Biol. Reprod. 49, 933--942 (1993).

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16. Kwon, O. Y. & Kono, T. J. Reprod. Fert. Abst. Ser. 17, 30 (1996).

17. Gurdon, J. B., Oxford University Press, Oxford 1974.

18. Finch, L. M. B. Biochem. Soc. Trans. 24, 369S (1996).

19. Whitten, W. K. & Biggers, J. D. J. Reprod. Fertil. 17, 399--401 (1968).

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21. Breslow, N. E. & Clayton, D. G. J. Am. Stat. Assoc. 88, 9--25 (1993).

22. Buchanan, F. C., Littlejohn, R. P., Galloway, S. M. & Crawford, A. L. Mammal. Gen. 4, 258--264 (1993).

(Observações da tradução:

· Para encontrar o texto original, vá à página da revista Nature e consulte a seção Letters to Nature da edição de 27/02/97. Lá está o trabalho do modo como ele saiu na revista.

· O trecho Métodos é cheio de siglas e expressões técnicas bastante especializadas. Para uso deste texto em nível não universitário, talvez fosse mais adequado utilizar-se somente a parte anterior aos Métodos, que é razoavelmente fácil de se entender, mesmo para leigos.

· Os números super-escritos se referem às referências bibliográficas que estão no final de todo trabalho científico. Por exemplo: “meio quimicamente definido ²⁰.“

· Os pontos em que há texto em itálico entre parênteses, na tradução, são explicações minhas a pontos que possam ser mais obscuros para os leigos em Biologia. Várias siglas, além dos nomes de algumas doenças, não pude traduzir, e espero encontrar seus significados em Português tão logo quanto possível.)

Texto traduzido por:

João M. P. Alves (Jota) em 17/3/97 e-mail: [email protected]
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